生物药物分析与检测：第五章 高效液相法

1、标题 第五章 高效液相色谱法 概述液相色谱法：以液体为流动相的色谱法；经典液相色谱：用常压输送流动相的方法；高效液相色谱法：是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，迅速发展起来的一种色谱分离技术。与经典液相色谱的区别是填充颗粒小而均匀。小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，因此需用高压输送流动相，故又称为高压液相色谱法（high perssure liquid chromatography).分离原理：当样品进入色谱柱后，流动相在高压作用下携带样品通过色谱柱。混合物中各组分按其在两相间的分配系数的不同先后流出色谱柱。HPLC的特点：1、速度快；2、分辨率高；3、灵敏度高；4、柱子可反复使

2、用；5、样品容易回收。相关术语色谱峰 Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底 Peak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰高 Peak Height峰最大值到峰底的距离峰宽 Peak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽 Peak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语峰面积 Peak Area峰与峰底之间的面积,又称响应值拖尾峰 Tailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰 Leading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰 Ghost P

3、eak并非由试样所产生的峰；亦称假峰液相色谱图相关术语基线 Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移 Baseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；N Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动液相色谱图相关术语保留时间，tR Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间保留体积，VR Retention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积基本理论色谱柱参数1、分配系数：即相平衡常数，指在一定温度下，化合物在固定相和流动相之间分配达到平衡时，在两相中的浓度比。2、容量因子:系指化合物在分配达平衡时

4、在固定相和流动相中存在量的比值。容量因子是色谱保留时间的反应。3、柱效参数柱效：色谱柱的分离效率，可定量的用理论踏板数N来表示。N=（tR/)24、分离度：一般采用分离度来定量表示相邻两峰的分离程度。用R表示。R=2（t2-t1)/(W1+W2)影响分离度的因素1、增加选择性；2、增加理论踏板数N；3、改变容量因子。定性和定量分析一、定性分析1、利用已知物对照法定性；2、色谱法与其他方法结合定性。二）、定量分析依据:色谱峰的峰面积或峰高与样品的量存在一定的关系。1）、外标法；2）、归一化法；3）、内标法；4）、追加法。外标法先利用对照品做出标准曲线，横坐标用对照品浓度，纵坐标用峰面积，得出标准

5、曲线后，再用待测品进行试验，同样得出峰面积，在标准曲线上对应找出浓度值，就得到了待测品的浓度。2、内标法实际操作中的问题一、分析方法的建立1 色谱柱的选择：疏水性的样品反相键合色谱；亲水性的样品正相键合色谱；生物大分子 体积排阻色谱；无机离子化合物离子对色谱；高分子聚合 凝胶色谱；同系物的分离吸附、分配和键合色谱；同分异构体 双键或取代基异构用吸附色谱； 多环芳烃异构选用反相键合；对映异构体 流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。2 流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。为达到较好的分离效果，确定流动相配比。流动相的总流量增加，通常柱效增加

6、。梯度洗脱-在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的Ph值来改善峰型。3 样品组分保留值的选择1. 分析时间控制在1030min ；2. 相邻组分分离度的要求： 对于难分离的样品,要求分离度R1.0。样品分析方法介绍1，流动相的准备流动相的选择-有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液）流动相的过滤-用孔径为0.45m滤膜过滤除去固体颗粒杂质。流动相的脱气-超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。2，样品的准备称量、用

7、流动相超声溶解、过滤。1流动相及样品的准备流动相过滤器样品过滤器6.2分析方法的设定流动相的配比及流量-选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。紫外检测波长的确定-通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如2080)及终点配比(如8020)。样品的分析1, 选定分析条件，走基线；2, 待基线平稳后，发出进样指令；3, 用进样针吸取已过滤好的定量样品；4, 进样分析，获得色谱图及分析结果；5, 如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。操作中常见问题及解决方案见P97HPLC的应用在食品研究中的分析应用食品中的天然成分碳水化合物

8、类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素农药和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸HPLC的应用在兽药研究中分析应用在医药研究中分析应用 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉

9、胺毒性小，L-异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。HPLC 的应用在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 HPLC的应用在公安、刑警破案工作需要毒品分析等在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测 * 2004年获悉，世界上化合物总数达到4700万，其中

10、绝大部分是有机化合物，而大约有70以上是不挥发的。对HPLC来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广泛的应用潜力。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第一步开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水

11、中的。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，使3-9号峰提前(曲线5，50-100%)，但是小峰仍没有分出来。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，使3-9号峰提前，改用50-95%见到好的现象。液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例梯度方法