程序性细胞死亡与发育生物学

1、程序性细胞死亡与发育生物学分子生物学发展到今日，研究方向逐渐聚集于发育生物学、神经生物学和结构生物学3个领域。发育生物学是一门飞速发展的学科，现已席卷整个生命科学领域。当今，关于发育生物学机制的研究正在运用细胞生物学和分子生物学手段进行探索，进行对生命现象在本质上的探讨与机制的阐明，这样，为生命科学和基础医学研究提供了分子水平的分析。 早在l9世纪，发育生物学者就观察到胚胎发育过程中，在胚体特定部位的特定细胞群体会在某一特定时间死亡，如进化中退化器官的消失；肢体 (指 、趾 )复杂形态结掏的形成；性别分化等发生细胞有序死亡的过程。如果这一过程受阻，个体正常形态就难以形成或出现畸形。通过多年来生

2、物化学、分子生物学研究，现已明确，细胞死亡的调节和细胞分裂的调节一样重要。多细胞生物的体内平衡不仅取决于细胞分裂，而且也受细胞死亡的影响，这是通过一个进化上保守的细胞自杀程序发生的生理过程。 1 程序性细胞死亡 (programmed cell deathPCD) 1972年，Kerr、wynie及Gurric等观察到机体在正常生理状态下的细胞形态学改变，首先提出程序性细胞死亡的概念。程序性细胞死亡这一特殊的细胞死亡类型是近些年来才引起科学界重视，是动物体以一种与细胞有丝分裂相反方式来调节细胞群体在维持机体内环境相对稳定的重要机制，它是一系列基因激活、表达及调节控制下的机体细胞有序死亡的过程。

3、现已确认，无论是胚胎发育或是胚后发育，机体无时无刻不存在程序性细胞死亡的过程。 程序性细胞死亡是一种特殊的、积极主动的生理过程，具有一定程序性，它的正常进行对维持动物体的正常发育，器官的正常形成，细胞与组织的正常功能维持机体内环境稳定，免疫系统的正常功能以及预防恶性肿瘤的发生均具有重要意义。正常生命个体的许多组织、器官中，正常的细胞死亡 (如组织细胞更新)是经常发生的，它与经典的细胞坏死 (cell necrosis)有本质的区别。 1.1. 细胞坏死的细胞生物学特征细胞坏死或意外性细胞死亡(accidental cell death)是由某种外界因素的作用，如局部贫血、高热、物理或化学损伤以

4、及生物侵袭等造成的急性死亡。细胞坏死呈成群细胞死亡，在病理组织学上，首先表现细胞膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，核肿胀，染色质不规则移位且稀疏呈网状，进而出现线粒体肿胀、染色质固缩 。最后，细胞膜破裂，细胞质外溢，细胞溶解。在坏死细胞周围常有炎症反应。1.2. 程序性细胞死亡的细胞生物学特征 曾有不少文献称，程序性细胞死亡即细胞捅亡(cell apoptosis)。凋亡一词源自希腊ap0(脱离)和ptosis(下降)组合而成，指树枝或花自然凋落现象。一般情况下，程序性细胞死亡与细胞凋亡有同等含义，可以通用，但二者又是不完全相同的概念，可归纳如下：程序性细胞死亡是一种功能性概念

5、，描述在多细胞动物体中，某些细胞死亡是个体发育过程中预定的，并受严格程序控制的正常组成部分；而细胞捅亡则是形态学概念，描述具有一整套形态学特征，它与坏死完全不同的细胞死亡形式。程序性细胞死亡仅存在于发育细胞，而细胞凋亡既存在于发育细胞，也存在于成体细胞，如肿瘤细胞等。程序性细胞死亡可能最后归结于细胞凋亡，但细胞凋亡并不一定包括程序化。多种刺激诱导的细胞凋亡，有些是受程序性控制，而有的是对周围环境变化所发生的反应，如细胞毒药物诱导的细胞凋亡则明显是非程序性过程，因为它不需要启动基因或合成物质。究竟二者细胞死亡启动信号是否相同，具体死亡步骤是否一致，与细胞本身特性是否有关仍需进行大量研究。2. 癌

6、基因与发育生物学 早在19世纪，就有人注意到恶性肿瘤的遗传倾向。随着分子生物学发展，从20 世纪60年代开始在DNA水平研究癌变的机制。癌基因(oncogene,ONC)的发现是近些年来生物学和医学的重大进展，并获1989年度诺贝尔医学和生理学奖，一直是细胞分子生物学和肿瘤学的研究热点。癌基因之所以能从狭小的肿瘤领域扩展进入发育生物学、神经生物学和免疫学的主要原因之一是其在细胞信息传递中发挥着重要作用。 2.1. 癌基因、细胞癌基因、原癌基因与抑癌基因的概念 癌基因，开始时是作为疾病携带的基因能引起靶细胞的转化，在肿瘤中分离并鉴定、且与肿瘤的生长、分化、调控存在极其密切关系而得名。癌基因的本质

7、是指一段具有促使细胞恶性转化 (malignant transformation)的DNA棱苷酸序列，若缺少这一片段DNA棱苷酸序列就丧失致癌能力。 就现有的知识，对癌基因可作如下的概述：癌基因是一类以原癌基因（preoncogene)形式存在于正常细胞中，在进化上高度保守，是维持细胞正常生命活动所必需的。从进化观点看，可以说，最早的原癌基因是从6亿年前，人与果蝇的共同祖先时代就已形成，在漫 长的用进废退自然选择中，这些原癌基因原封不动地保存到今日。脊推动物的许多癌基因，在进化上都表现其高度保守性 。 随着研究深入，发现在正常条件下，原癌基因是细胞生长、繁殖、个体发育所必需的，如哺乳动物胚胎期

8、间，某些胚胎细胞的原癌基因非常活跃，从受精卵分裂增殖，直至胎儿形成的发育进程中，细胞分裂增殖的速度远远超过恶性肿熘细胞的分裂速度。为了区别细胞癌基因和原癌基因，科学家将正常细胞中以非激活形式存在的细胞癌基固称原癌基因，将已被激活的原癌基因称细胞癌基因。按照癌基因的结构、产物的功能以及在细胞内的位置，可分为酪氨酸激酶类、生长因子类、核内蛋 白类等。 目前，已发现的细胞原癌基因已有100多种，其中约有半数既存在于逆转录病毒，也存在于细胞基因组中；另有半数只存在于细胞基因组中，癌基因通常以3个斜体小写英文字母命名，细胞癌基因在其名称前标以小写 c(cellular)，如 cmyc基因；病毒癌基因则在

9、其名称前标以小写v(virus)。 与癌基因发现的同时，发现在正常细胞中存在一类能抑制正常细胞发生恶性转化和肿瘤发生的基因，称抑癌基因(lurnor suppresser gene) 或抗癌基因 (antioncogene)，此种基因丢失或失活都可导致正常细胞的恶性转化和肿瘤发生。60年代末，已有实验证明，正常细胞与癌细胞在体外培养条件下融合，其杂交细胞的致癌性降低或消失，究其机理，可能是 由于正常细胞中存在阻抑癌变的基因。抑癌基因在维持基因稳定诱导程序性细胞死亡，调节细胞生长，抑制蛋白酶活性等有重要作用。癌基因与抑癌基因的种类很多，已知，癌基因约有百来种，而抑癌基因当前只有l0多种被发现，推

10、论二者的数量可能相当，它与程序性细胞死亡的关系千变万化，二者功能大相迳庭。 2.2. 与发育有关的细胞癌基因及其功能 如上所述细胞癌基因是正常细胞的固有基因成份，同时具高度进化保守性，因此，必定有其重要生理功能。随着对癌基因产物的结构、功能及其在细胞中定位等问题的深入了解，越来越清楚认识到原癌基因在维持生长、繁殖、分化和发育等基本生命活动中起着关键性作用，但其机制尚不清楚。在已报道的百来种癌基因中，已发现有20多种与动物个体发育有关。随着对癌基因研究的不断进展，发现与发育有关的癌基因越来越多，虽然有相当一部分还不明确其信息传递、基因调控中的具体功能，但在应用免疫组化用标记的特异性抗体 (抗原)

11、对组织细胞内抗原(抗体)的分布进行定位，在组织原位显示抗原 (抗体 )的技术；原位杂交 (一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA)；核酸杂交（指来源不同的单链DNA或单链RNA，通过碱基配对形成异质双链核酸分子的过程，包括DNA与DNA、DNA与RNA、RN与RNA之间的杂交 )；基因定点突变 (即基因突变，指基因内一个或多个位点上的碱基替换或由于碱基的掺入或缺失造成移码所导致的突变)和转基因动物(基因组中含有外源基因的动物)等方法已揭示出这些基因在胚胎发育中定点、定时的表达，表明其对胚胎正常发育的重要作用，但许多细节有待进一步研究。细胞周期 (

12、cell cycle)是细胞周而复始的分裂过程。真核细胞的细胞周期包括G1期 (合成前期)、S期(合成期 )、G2期(合成后期)和M期(有丝分裂期 )。每个细胞期都有其特殊功能，各细胞期之间都有转折点。这种细胞周期性的反复进行说明它是受控制的过程。细胞周期的有序运行是细胞增殖过程的主要保证，这种有序运行是受一系细胞分裂周期基因(cell division cyelegene，coc)顺序表达的调控。 各种细胞因子如生长因子、控制因子、分化因子相互协调并影响细胞周期的进行。 目前，已发现和证实了许多具有调节发育途径的相关基因，它们能确实引导细胞及其子代细胞进入特异性分化传导途径。某些癌基因可直接

13、表达生长因子样活性物质，许多生长 因子可促进一些癌基因的表达。某些癌基因位于细胞核内，其表达产物是一类DNA结合蛋 白，在不分裂的静止细胞中，这些癌基因不表达或表达很低，而在细胞增殖信号作用下，其表达明显异高。虽然对发育过程中的癌基因蛋白进行了一系列研究，但目前还没有系统的结论和解释，还有许多癌基因的功能还不是很清楚的。应该知道，不论是胚胎组织或成体组织，细胞癌基因的表达均呈现严格的细胞类型和时相特异性，目前，对其了解也很少，故是当前重大究课题之一。3. 发育生物学与程序性细胞死亡 发育生物学最主要目的是阐明生命现象本质遗传和发育是个体发育过程的两个方面，直至19世纪末，二者常常没有明确的界定

14、。遗传和发育毕竟是有所差异，由于着眼点和思路有所分歧，从而各自发展出一套研究方法。发育过程中由于是在一定时间，按一定模式，“循序而进”的变化，即使在离体条件下也不例外，因此，就存在“程序”问题，这既有发育问题，也有遗传问题。可以说，发育的研究进入遗传领域，是从性状发育到基因的调控，来了 解整个胚胎发育过程中的程序控制。这种发育过程的时间、空间程序，取决于基因括动在时间和空间的调控。因此，遗传和发育既是事物发展的两个方面，就应联系起来；可以说，没有遗传就没有发育，没有发育也无所谓遗传。因此，分道扬镳已久的遗传和发育的研究呈现分久必合的趋势，只有这样才能较全面地看问题。 早期胚胎学偏重于胚胎结构和

15、发育形态的描述20世纪50年代开始逐步进入发育分子生物学时期，已对胚胎发育中的基因调控和细胞分化机理进行研究。 细胞基因功能已被认识，生物化学家研究基因与蛋白质间的联系及细胞代谢过程中酶的作用；电镜、同位素和分子杂交等技术的的广泛应用，使发育生物学从叙述性胚胎学进入发育分子体系中重要组成部分。 发育生物学是程序性细胞死亡主要材料来源，同时，程序性细胞死亡叉为发育生物学开辟了新的研究领域。 发育是一系列相互作用过程，又是复杂性不断增加的一系列过程，胚胎学与生物化学结合起来、使人们对发育现象有了更深入的认识，从而使DNA、RNA、蛋白质、酶等成为胚胎发育研究的中心课题。实验证明在整个发育过程的不同

16、时期和胚胎的不同部分形成了各种蛋白质和各种酶，在各个发育阶段都有新的蛋白质和新的酶合成。 由于分子生物掌的渗入，使我们认识到，不论是低等真核生物或是高等生物，各个发育阶段的形态发生均有准确的时闻、空间结构排列和发育间期，其过程都受基因组中的DNA 调控，并且按照特定的时间和空间程序（temperal and special sequence）依次表达，从而认识形态发生的空间结构、所需时间和间期在各类细胞具有其特殊模式过程的实质。现已确认，除少数例外，在胚胎发育过程中，有丝分裂把DNA均等分配到子代细胞中，几乎所有的新生细胞都接受了完整的基因组信息。最初的胚胎细胞具基因等阶性（genomic e

17、quivalence），即每一个细胞均有相同的基因组，并具有发育成任何类型细胞的潜能。随着发育进程，虽然每一个细胞均含有一套完整遗传指令，但在每一特定类型的细胞只使用其中一小部分遗传信息，每一类型细胞只表达一套特异蛋白质。不同细胞类型，表达不同基因。基因组的哪些部分将被使用，哪些部分不使用，是在细胞决定（determination）时将特殊的“使命”赋于细胞并进入顺序性分化过程。生物代代相传，雄性生殖细胞中的遗传信息（核内DNA及胞质DNA）和雌性卵细胞携带信息（母体信息，胞质决定）赋于有机体自我复制能力，按照相同时间和空间顺序构建世代相同的结构和模式。3.1. 胚胎发育进程中的细胞死亡和无用

18、组织的消失 从低等到高等动物的发育都存在程序性细胞死亡现象，它对胚胎发育起到重要调节作用，具有广泛意义的生物学现象。在畜禽胚胎发生、发育和成熟过程中，细胞的生长和死亡交替发生，无时无刻不存在程序性细胞死亡过程，使体内细胞的增殖和死亡处于一个动态平衡。个体发育过程中，细胞死亡不是任意的，组织消失过程是有选择性的。预定死亡的细胞在特定部位、特定时间退化，而整个胚体仍然保持活力并继续生长发育，因此，必然是整个发育程序中精确调控的一部分。发生程序性死亡的细胞，部分是进化过程中退化的细胞、组织或器官；部分是胚胎发育某一特定阶段发挥作用的细胞群。在个体发育过程中，胚胎组织所产生过量细胞的大部分都将死亡，只

19、有一部分存留下来形成成熟的组织，因此，胚期的细胞死亡和无用组织的消失是构成胚体正常形态、结构所不可缺少的。胚体外形轮廓的形成也是由局部细胞有选择性地死亡才能成形，目前，对这一问题的机制虽有所了解 ，但真正的机制还不清楚。近年来研究发现，小鼠胚胎着床前 （即从一个受精卵到囊胚期的卵裂过程）的发育阶段也有程序性细胞死亡发生，即在卵裂的同时，也有细胞碎片形成，而且细胞碎片的多少则是判断胚胎质量优劣的一个重要标志。本文提供部分的实例供参考。3.1.1. 线 虫 发 育 中 的 程 序 性 细 胞 死 亡 ： 线 虫（Nenlaiode）由于其解剖结构简单、身体透明、遗传操作容易，特别是其每一个体或繁殖

20、每一代细胞谱系的高度精确性，已成为发育生物学研究的模式动物。对线虫发育的基因调控较为清楚，是研究真核生物发育遗传学，细胞生物学，神经生物学的一个好材料。图3 线虫 雌雄同体、胎生线虫的形态。生殖腺有两个臂，每条臂含有卵子和精子，精卵都储存在受精巢内。胚胎在子宫的最后部位发生。 线虫生命周期很短（3.5d），胚胎发生持续期约12h（在25）或18h（16）。线虫通常是两性的，既能产卵，又能产生精子。线虫体细胞数目有限，在胚胎期有1090个体细胞，到成虫时只有959个体细胞组成，说明，有131个体细胞在发育过程中发生程序性细胞死亡。神经系统由302个神经细胞组成，这些细胞来自407个前体细胞，推测

21、前体细胞有105个细胞发生程序性死亡。线虫在发育过程中，哪些注定要死亡的细胞十分确定，因此，就为程序性细胞死亡研究提供了许多方便。线虫发育过程中的程序性细胞死亡是一种重要的生物学观察，具有复杂的生物学机制及意义。线虫细胞在胚胎发育和胚后发育期存在两种细胞死亡类型，即程序性细胞死亡和病理性细胞死亡，对其深入研究，有利于程序性细胞死亡分子机制的深入认识，和促进人体与高等动物体细胞程序性死亡的研究和探索。3.1.2. 脊椎动物胚期泌尿器官发育与程序性细胞死亡：哺乳动物和其它高等脊椎动物在胚胎发育阶段，泌尿器官和生殖器官均起源于中胚层，二个系统均明显出现暂时性生存的结构。这些结构在成体已消失，但它反映

22、了动物进化历史的过程。高等动物成体阶段结构常在胚胎发育较晚阶段出现，而那些早期出现的，较原始的，而且最终将消失的器官、组织，在它们消失前，常对进化较高级器官的形成起着重要的作用。 脊椎动物泌尿器官起源于体节旁侧的间介中胚层，由它陆续发生前肾中肾后肾的分化过程。肾的3个发育过程有顺序诱导作用，即前肾诱导中肾形成，中肾又诱导后肾形成，并且各组成细胞之间又有相互诱导作用。前肾是原始的肾，在脊椎动物发育中很早发生，但除原始鱼类外，在所有脊椎动物体内都己退化。虽然，前肾在发育过程中非常早退化，但它的管道系统却保留下来，对中肾、后肾及生殖系统的发育起着主要诱导作用。前肾发生时，前肾管从前肾向后生长，直通肛

23、门前的消化管。中肾从未分化的生肾组织发生，它受前肾管的诱导向中肾方向分化，中肾的肾小管与中肾管相通，至此，前肾管改称为中肾管。在发育时，如果前肾管被破坏，则从破坏处后段就没有中肾的分化。后肾是成体终生肾，它的形成依赖中肾管。在中肾管后端产生输尿管芽，它朝生肾组织的前方生长，形成后肾管或称输尿管。当输尿管芽与生肾组织接触后，即诱导形成后肾。如果中肾管后端被破坏，则不形成输尿管芽，也就不能诱导后肾的发生。输尿管芽作为后肾发育的诱导者，当它伸入间质，使间质诱导分化并增殖，同时，输尿管芽被诱导而分支。 上述的发育过程中, 无用组织的消失过程是有选择性的, 预定死亡的细胞在特定时间和部位退化而消失, 而

24、整个动物体仍继续生长发育, 有实验将大鼠胚胎发育13d的后肾间质分离出来培养, 可见未诱导的间质出现程序性细胞死亡所特有的形态特征, 如核碎片、核质凝集、细胞核内DNA降解为200bp的小片段。3.1.3. 性腺细胞发育与程序性细胞死亡：在小鼠妊娠第7天的雌雄两性胚胎，均可鉴定出原始生殖细胞（primordial germ Cell, PGC），经过一段时间增殖和迁移到达性腺，开始发育成卵子或精子。原始生殖细胞在胚胎发育过程中的死亡，具有程序性细胞死亡的典型特征。在妊娠第12天以前的两性小鼠胚胎，都未见到生殖细胞程序性死亡现象，雌性胚胎第13天时，可见卵原细胞发生程序性细胞死亡；第15天及17

25、d可见卵母细胞的程序性细胞死亡。在雄性胚胎第13天至第17天都可见到生殖细胞程序性死亡。两性小鼠生殖细胞死亡，都未见到致密的核、染色质密度增加、着色深、断裂及边缘化等现象及细胞碎片被邻近的体细胞吞噬过程。生殖细胞发生程序性细胞死亡的分子生物学机制有待深入研究。3.2. 发育过程的细胞分化细胞分化（cell differentiation）指胚胎细胞分裂后未定型的细胞，在形态、生理生化和功能上向专一性和特异性方向分化的过程。细胞分化是发育生物学的核心问题，是多细胞生物体形态发生的基础，是个体细胞之间产生稳定性差异的过程。细胞分化在胚胎期达到最大限度，一个细胞一旦分化为稳定类型之后，就不能逆转到未

26、分化状态。每一种动物个体都是由许多分化的细胞和组织构成的，细胞要分化必须先获得决定(determination），决定是将特殊的 “使命”赋予细胞并使其进入程序性分化过程。细胞首先要获得初步决定，继之进行初步分化。随着初步分化而决定趋于稳定，稳定的决定更有利于细胞分化，所以，二者是相辅相成交错进行的过程。大量研究证实，鼠、兔、牛、猪等哺乳动物8-16细胞以前的细胞是全能性的细胞，也是早期胚胎决定的时间。细胞决定主要表现在细胞分化为滋胚层和内细胞团。 细胞分化实质是不同类型细胞合成不同种类的特异性蛋白质，即当细胞分化时，某一类型细胞仅有某些基因被激活，导致各类细胞合成其特有的蛋白质，以执行其不同

27、的功能。实验证明，细胞中基因并不都与细胞分化有直接关系，细胞分化主要是奢侈基因（luxrygene，亦称可调节基因、可诱导基因，是在特殊类型细胞中为特化功能蛋白质编码的基因）中某种特定基因有选择地表达的结果，导致产生一种类型的分化细胞。 一种类型细胞在不同发育阶段可以有不同形态和功能，这是在时间上的分化；同一种细胞后代，由所处环境不同而有相异的形态和功能，这是空间上的分化。单细胞生物仅有时间上的分化，多细胞生物既有时间上的分化，且在同一个体上的各个细胞所处位置不同，而产生功能上的分工，就有空间变化，表现在一个生物体内部与外部、前端与后端、背面和腹面等部位。 生物体的一生是一个生长、发育过程，它

28、不仅有生长，既有量的变化，而且也有质的变化，表现在生物体的细胞分化、形态发生、成熟和衰老等生命过程。胚胎发育进程中的显著特征是细胞始终处于细胞周期（ G1、S、G2、M）循环之中，直至决定其最后命运的时空开关打开后才进入细胞分化阶段。此时，总能观察到癌基因的表达，这表明癌基因对细胞周期和细胞分化有极重要的关系。然而，当胚胎细胞和成体组织的干细胞趋向成熟时，活跃的癌基因表达通常即行丧失。 由于分子生物学的进展，发现发育与遗传在分子层次有内在联系。当前，对细胞分化的研究已从单纯形态学研究进入细胞和分子层次。从分子层次看，细胞分化意味着细胞内某些特异性蛋白质的优先合成，如红细胞内的血红蛋白、浆细胞内

29、的-球蛋白以及肌肉的肌动蛋白和肌球蛋白。为了诱发这种合成，特定细胞内的某些基因必须在一定时间内被激活，即各种细胞表达的时空关系。这种时空关系早已由生物体的遗传性规定了严格的程序和模式。因为，通过遗传的调节机制，决定任何一个组成细胞在何时、何处、何种情况上表达哪一个基因。由于基因表达需要一定条件，细胞分化也有其环境因素。一般说，低等动物及植物较易接受外界环境的影响，而高等动物则因其胚胎发育的外环境及其成体发育的内环境比较恒定，因此，细胞分化更多地直接由基因所支配。由于有关细胞分化的实质性问题，目前4.结语了解尚不够深入，许多问题有待今后进一步研究。发育生物学是21世纪的前沿学科之一。当前，发育分子生物学的主要研究方向是基因表达的时空调节、发育过程中细胞信号传导途径、癌基因的激活和抑癌基因的失活等问题。在发育进程中，除了细胞内的DNA、RNA和蛋白质合成有一定规律外，在形态发生上也有一定程序，发育