第4章酶的分离与纯化

1、 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l酶纯化的特点： 1）在细胞中的含量少 2）可以测定酶活力跟踪酶l判断分离纯化方法： 1）总活力的回收率 2）比活力提高的倍数 比活力：在特定条件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力单 位数1）预处理）预处理（pretreatment） 包括发酵液处理和细胞破碎等2）初步纯化）初步纯化（rough fractionation） 除去与目的产物性质差异很大的杂质 盐析，等电点沉淀和有机溶剂沉淀等3）高度纯化）高度纯化（fine fractionation） 除去与产物性质相似的杂质 层析，电泳法等4）浓缩与干燥）浓缩与干燥（concentration and

2、 desiccation） 使酶与溶剂分离的过程 旋转蒸发，透析，超滤和冷冻干燥等。 第一节第一节 酶的分离酶的分离一、发酵液预处理一、发酵液预处理( (一一) )发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化 无机离子的去除：形成沉淀无机离子的去除：形成沉淀2.2.杂蛋白质的去除：沉淀法，变性法，凝聚杂蛋白质的去除：沉淀法，变性法，凝聚和絮凝和絮凝3.3.色素及其他物质的去除：活性炭、交换树脂等色素及其他物质的去除：活性炭、交换树脂等( (二）发酵液的固液分离：二）发酵液的固液分离：离心和过滤离心和过滤1 . 影响发酵液过滤的因素影响发酵液过滤的因素 1）菌种：真菌，放线菌，细菌）菌种：真菌，放线菌，细菌

3、 2）培养基组成：原料和发酵时间（粘稠度）培养基组成：原料和发酵时间（粘稠度）2. 提高过滤性能的方法提高过滤性能的方法 1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚 2 2）稀释、加热）稀释、加热 3 3）加助滤剂，）加助滤剂，常用硅藻土等。常用硅藻土等。 微生微生物物 革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌 革兰氏阴性革兰氏阴性细菌细菌 放线放线菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 同同G+100 300 100 250 层次层次 单层单层 多层多层 多层多层 多层多层 主要主要组成组成 肽聚糖肽聚糖(40% 90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1%2%) 肽聚糖

4、肽聚糖(5% 10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11% 22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30% 40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)几丁质几丁质(1% 2%)蛋白质蛋白质(6% 8%)脂类脂类(8.5% 13.5%)多聚糖多聚糖(80% 90%)脂类脂类蛋白质蛋白质 各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 二、细胞破碎二、细胞破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声波破碎法X-press 通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。物理破碎温度差破碎法压力差破碎法通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结

5、构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween化学试剂可以改变细胞壁化学试剂可以改变细胞壁或细胞膜的通透性，而使或细胞膜的通透性，而使细胞内物质有选择性的渗细胞内物质有选择性的渗透出来透出来酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机高压细胞破碎机高压细胞破碎机匀浆机匀浆机（

6、三）细胞破碎确认（三）细胞破碎确认 1.1.直接测定破碎前后的细胞数：直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.2.测定导电率：测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。估算破碎率。 三、酶的提取三、酶的提取(extraction)(

7、extraction) l 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来，以把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来，以供进一步从中分离纯化所需要的酶。供进一步从中分离纯化所需要的酶。l 提取目标：提取目标： a. 将目的酶最大限度地溶解出来，尽量少的杂质从将目的酶最大限度地溶解出来，尽量少的杂质从原料中引入溶液。原料中引入溶液。 b. 保持生物活性。保持生物活性。提取液：溶解度大，破坏小；对杂质不溶；价格低廉，操作安全。提取液：溶解度大，破坏小；对杂质不溶；价格低廉，操作安全。 提取方法提取方法：（一）盐溶液提取（一）盐溶液提取 盐溶（盐溶（salting insalting in） 浓度控制在

8、浓度控制在0.02-0.5mol/L0.02-0.5mol/L的范围内，常用的范围内，常用NaClNaCl，浓度，浓度为为0.15mol/L0.15mol/L。 提取液的体积是原料体积的提取液的体积是原料体积的1-51-5倍。倍。 提取的温度视目标酶的性质而定。提取的温度视目标酶的性质而定。l（二）酸、碱溶液提取（二）酸、碱溶液提取 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，0.12mol/L 硫酸提取 L-天门冬酰胺酶,pH 11-12.5 pH远离等电点 防止蛋白变性l（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取 与脂结合牢固或分子中非极性侧链较多的酶，不溶于水，酸或碱中。 乙醇、丙酮和丁醇四、四、 离心分离离心分

9、离借助离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。离心分离的形式：离心分离的形式：1 1）离心沉降：离心沉降：固液分离2 2）离心过滤：过滤）离心过滤：过滤介质3 3）离心分离：）离心分离：分离相对密度不同液体离心力表示方法：离心力表示方法： 每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。相对离心力相对离心力（RCFRCF）表示，如：）表示，如：65000g65000g。Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数为离心机每分钟转数 （r/min ）；）；Fc通常以相

10、通常以相对离心力对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，）表示，即离心力即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用的多少倍。一般用g（或数字（或数字 g）表示。）表示。两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。计算近似计算近似RCF的列线图的列线图（二）离心机的种类（二）离心机的种类 按离心机转速的不同，分为：按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 名称名称 转速转速(r/min)(r/min) 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 80008000 常温，注意样品热变性和

11、常温，注意样品热变性和离心管平衡离心管平衡 高速离心机高速离心机 10, 000 26, 000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 26, 000冷冻真空系统（减少空冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），气阻力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类离心机的种类 l温度类型：温度类型：常温及常温及冷冻冷冻l超速离心机均为冷超速离心机均为冷冻型。冻型。l使用冷冻离心机时使用冷冻离心机时提前降温，预冷离提前降温，预冷离心头。心头。l使用超速离心机时使用超速离心机时先抽真空。先抽真空。l角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式

12、及外摆式：外摆式一般为低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。作注意稳、盖、旋紧。l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。（三）常用离心方法（三）常用离心方法 差速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心1差速离心差速离心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速采用不同的离心速度和离心时

13、间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法度不同的颗粒分批分离的方法。特点：特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：优点：操作简单操作简单 。缺点：缺点：1）分离效果较差，分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。 2）壁效应严重。）壁效应严重。 3 3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压。 差速离心分离示意图差速离心分离示意图 （a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 2密度梯度离心密度梯度离心 （density gradient centrifugat

14、iondensity gradient centrifugation） 样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。分离方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗糖溶液。溶液。 密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图 （a a）离心前）离心前 （b b）离心后）离心后 特点：特点：l适宜分离密度相近而大小不同的固相适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质物质。l区带内颗粒均一，分离效果好。区带内颗粒均一，分离效果好。l区带位置和宽度随时间的不同而改变。区带位置和宽度随时间的不同

15、而改变。Density gradient ultracentrifugation3. 等密度梯度离心等密度梯度离心 又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心 （sedimentation sedimentation equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根据根据颗粒的密度不同颗粒的密度不同而进行分离。而进行分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成浮，达到与其相同的密度时不再移

16、动，形成区带。区带。 常用常用氯化铯氯化铯（CsClCsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。特点：特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。的物质。 等密度梯度离心示意图等密度梯度离心示意图 （a a）离心前；）离心前； （b b）离心后）离心后 密度梯度离心密度梯度离心等密度梯度离心等密度梯度离心梯度梯度介质介质通常用蔗糖通常用蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度密度密度最大的沉降样品最大的沉降样品离心离心条件条件在最前的沉降物质达在最前的沉降物质达到管底前停止，短时到管

17、底前停止，短时间，低速度间，低速度使各组分沉降到其平衡使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高的密度区，长时间，高速度速度分离分离依据依据密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系数不同数不同沉降系数相近，但密度沉降系数相近，但密度不同不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点总结总结：等密度梯度离心等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。使之包括待分离物的密度范围。差速离心差速离心是一种动力学方法，关键在于选是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物

18、的离心力。择适合于各分离物的离心力。密度梯度离心密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。关键在于制备优质的密度梯度溶液。五、沉淀分离（根据溶解度的不同）五、沉淀分离（根据溶解度的不同） 通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出。 浓缩作用浓缩作用 纯化作用纯化作用l在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：l 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）l 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀l 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性）l 等电点沉淀等电点沉淀l 有

19、机聚合物沉淀有机聚合物沉淀（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（一）盐析沉淀法（改变离子强度） 1. 基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：产生两种现象： 1) 盐溶盐溶（salting insalting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析盐析（salting outsalting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度 原

20、因：原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 不同蛋白质表面极性基团、电荷数目和不同蛋白质表面极性基团、电荷数目和分布不同，他们的盐析浓度有差别。分布不同，他们的盐析浓度有差别。 采用加入中性盐的方法，使各种蛋白质采用加入中性盐的方法，使各种蛋白质依次分别沉淀的方法依次分别沉淀的方法称分段盐析。称分段盐析。l1）中性盐的选择）中性盐的选择l 常用常用(NH4)2SO4，其突出优点：，其突出优点：l a. 溶解度大溶解度大l b. 分离效果好分离效果好l c. 不易引起

21、变性不易引起变性l d. 价格便宜价格便宜l2. 盐析用盐盐析用盐2) 盐浓度的表示盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度饱和度 溶液的总体积溶液的总体积3) 调整盐浓度的方式调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。浓度又不太高时。 配制饱和硫酸铵溶液配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算： S2-S1 V=V0 1-S2式中式

22、中 V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积体积及原溶液体积S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度原来溶液的硫酸铵饱和度b. 添加固体硫酸铵添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据按下式计算，得表中数据 B(S2-S1)W= 1-AS2A,B常数，与温度有关。常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。需加固体硫酸铵

23、的量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过终饱和度不超过4040。l高饱和度：高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。l1 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。l2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。l3 3）沉淀再溶解后可用超滤）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltrationultrafiltration）

24、 、透、透析析（dialysisdialysis）或层析或层析（chromatographychromatography）方法脱盐。方法脱盐。 硫酸铵浓度（硫酸铵浓度（% %） 枯草杆菌枯草杆菌 - -淀粉酶发酵液的盐析曲线淀粉酶发酵液的盐析曲线 l1) 蛋白质浓度：蛋白质浓度：l 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。 l2) pH值：值：等电点处最易沉淀。等电点处最易沉淀。l3) 温度的影响：温度的影响：l稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。l浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。浓盐

25、溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。l 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。l4. 盐析的影响因素盐析的影响因素（二）（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数）l 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。不同而使之分离的方法。l1. 沉淀机理沉淀机理l 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数l 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水l2. 常用有机溶剂常用有机溶剂l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积甲醇，用量一般为酶液体积的的2 2倍左右，终浓

26、度为倍左右，终浓度为70%70%。 l3.优缺点：优缺点：l 优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高l 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐l 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心l缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白质变性失活l2)2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 l l4. 影响有机溶剂沉淀的因素影响有机溶剂沉淀的因素（1 1）温度）温度 ：低温（低温（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：尽可能靠近其等电点。尽可能靠近其等电点。 （3 3）离子强度：）离子强度：采用采用 0.05mol/L0.05m

27、ol/L的稀盐溶液的稀盐溶液 增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 目的目的 防止蛋白质变性防止蛋白质变性 （4 4）蛋白质浓度：）蛋白质浓度：适当，一般为适当，一般为5 52020mg/ml mg/ml （三）（三） 等电点沉淀等电点沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric precipitation) l1.原理原理l 蛋白质在等电点时溶解度最低蛋白质在等电点时溶解度最低l 不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 l2. 使用方法使用方法l 单独单独使用使用较少（较少（用于从粗酶液中除去某些等电用于从粗酶液

28、中除去某些等电点相距较大的杂蛋白）点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用，多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质蛋白质在等电点时在等电点时仍有一定的溶解度。仍有一定的溶解度。l3. 优点：优点：l 1）大多数蛋白质的大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内都在偏酸性范围内l 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低l 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化l4. 缺点：缺点：l 酸化时，容易引起蛋白质失活酸化时，容易引起蛋白质失活l （四）有机聚合物沉淀法（四）有机聚合物沉淀法 1.

29、 作用机理：作用机理： 与有机溶剂类似与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。，是发展较快的一种新方法。2. 沉淀剂：沉淀剂：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写，简写 PEGPEG ） 多用分子量为多用分子量为600020000的的 PEG。3. 优点：优点：l操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。l沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当即可沉淀相当 l 多的生物大分子。多的生物大分子。l沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。l（五）选择性变性沉淀法（五）选择性变性沉淀法l 选择一

30、定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 l 热变性热变性l 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。l pH变性变性l 等电点沉淀法是等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。l 有机溶剂变性有机溶剂变性l 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。六、萃取（六、萃取（extraction）分离）分离 一个液相中

31、的溶质经过物理或化学作用转移一个液相中的溶质经过物理或化学作用转移到另一液相的过程。到另一液相的过程。利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。l特点：特点：l1）比沉淀法分离程度高）比沉淀法分离程度高l2）比离子交换法选择性好、传质快）比离子交换法选择性好、传质快l3）比蒸馏法能耗低）比蒸馏法能耗低 （一）溶剂萃取法（一）溶剂萃取法 明确几个概念：明确几个概念：料液：料液：供提取的溶液。供提取的溶液。 溶质：溶质：料液中欲提取的物质料液中欲提取的物质。萃取剂萃取剂 ：用来进行萃取的溶剂，通常

32、是有机溶剂用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。萃取液萃取液 ：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液萃取剂形成的溶液。萃余液：萃余液：被萃取出溶质后的料液。被萃取出溶质后的料液。反萃取（反萃取（back extractionback extraction）：）：完成萃取操作后，完成萃取操作后， 将产物从有机相转入水相的萃取操作。将产物从有机相转入水相的萃取操作。 l溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律衡规律 ）为基础。）为基础。l 在一定温度、压力下，溶质分布在两个在一定温度、压力下，溶质分布在两个互

33、不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。相中的浓度比为一常数。l 萃取相浓度萃取相浓度 C1l分配系数分配系数 K K0 0 = = l 萃余相浓度萃余相浓度 C2l K K0 0值随溶液值随溶液pHpH的变化甚大，这是用萃取的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。法实现溶质提取的重要基础。萃取操作的萃取操作的3 3个步骤：个步骤： 1）混合：料液和萃取剂充分混合）混合：料液和萃取剂充分混合 2）分离：萃取相和萃余相）分离：萃取相和萃余相 3）溶剂回收：分离有机溶剂）溶剂回收：分离有机溶剂l单级萃取单级萃取l 使用一个混合器和一个

34、分离器使用一个混合器和一个分离器l 单级萃取流程单级萃取流程93l 普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离， l 因为因为:l1） 蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂l2） 蛋白质在有机相中易变性失活蛋白质在有机相中易变性失活 故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。分子生物物质的提取。 （二）（二） 双水相萃取技术双水相萃取技术l 又称水溶液两相分配技术又称水溶液两相分配技术l（partion of two aqueous phase systempartion of two aqueous

35、 phase system） l 用两种不相溶的亲水性高分子聚用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡）和葡聚糖（聚糖（DextranDextran）进行萃取。由于形成）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达的两相均有很高的含水量（达70%70%90%90%），故称），故称“双水相双水相”系统。系统。 l优点：优点：l1 1）每一相中均有很高的含水量，为每一相中均有很高的含水量，为 酶等生物物质提供了一个良好的环境；酶等生物物质提供了一个良好的环境；l2 2）PEGPEG、DextranDextran和无机盐对酶等无毒和无机盐对酶等无

36、毒 害作用，不会引起变性。害作用，不会引起变性。 双水相的形成：双水相的形成： 两种不同水溶性聚合物浓度达两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。相容的两相，构成双水相体系。 l 几种典型的双水相系统几种典型的双水相系统l聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇l 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l 羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇l羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素甲基纤维素l聚乙二醇（聚乙

37、二醇（ PEG） 磷酸钾、磷酸钾、硫酸铵硫酸铵l 硫酸钠、硫酸镁硫酸钠、硫酸镁2. 萃取原理：萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。性分配。3. 应用应用: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。除去细胞碎片，并使酶得到纯化。l 几种典型的双水相萃取酶蛋白实例几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶酶 菌菌 种种 相系统相系统l延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐盐l天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐盐l -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐盐l亮氨酸脱氢酶亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp.

38、 PEG/Dexl乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/ 盐盐l青霉素酰化酶青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐盐 双水相萃取法的重要研究方向双水相萃取法的重要研究方向 亲和萃取（亲和分配亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（使用具有生物特异性的配基（ligandligand）来提高分离选择性和产品的纯度。来提高分离选择性和产品的纯度。配基以游离或以共价结合方式与聚合物配基以游离或以共价结合方式与聚合物（PEG)PEG)联接在一起的形式存在于系统中，联接在一起的形式存在于系统中，配基与欲提取的蛋白质有很强的亲和力。配基与欲提取的蛋白质有很强的亲和力。 蛋白质

39、蛋白质配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脱氢酶甲酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶三嗪染料三嗪染料l（三）（三） 超临界流体萃取超临界流体萃取l 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。萃取剂。 l 超临界流体超临界流体(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超过气液共存时的最高压力和最：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点高温度下物质特有的

40、点临界点后的临界点后的流体流体。 临界点的概念临界点的概念可用临界温度和临界可用临界温度和临界压力解释：压力解释：l临界温度：临界温度：高于此温度时，无论加压高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。多大也不能使气体液化。l临界压力：临界压力：在临界温度下，液化气体在临界温度下，液化气体所需要的压力。所需要的压力。l lSCF性质性质介于液体和气体之间介于液体和气体之间 ：l1) SCF密度接近于液体，溶解度高。密度接近于液体，溶解度高。l2) SCF粘度和扩散系数接近于气体，粘度和扩散系数接近于气体， 传质扩散快传质扩散快。l基本过程：基本过程：l1）在）在SCF中，溶解度大的物质溶于中，

41、溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。分开。l2）降低压力，使）降低压力，使SCF变为气态（密变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。取物与溶剂分离。l常用超临界液态常用超临界液态CO2作为萃取剂，作为萃取剂， l 因为：因为：l1）液体）液体CO2无毒无毒l2）临界温度（）临界温度（304.06K）接近常温）接近常温l3）临界压力（）临界压力（7.38MPa）较低）较低l4）操作安全）操作安全l超临界超临界CO2萃取技术在生物、食品萃取技术在生物、食品l等工业中的应用等工业中的应用l CO2萃取部分

42、产品萃取部分产品l原料名称原料名称 产物名称产物名称 原料名称原料名称 产物名称产物名称l小麦胚芽小麦胚芽 胚芽油胚芽油 豆子豆子 豆油精炼油豆油精炼油l啤酒花啤酒花 啤酒花精油啤酒花精油 茉莉花茉莉花 净油净油l辣椒辣椒 辣椒红色素辣椒红色素 菊花根菊花根 除虫菊酯除虫菊酯l当归当归 精油精油 紫草紫草 紫草宁紫草宁l银杏叶银杏叶 银杏内酯银杏内酯 花生花生 精炼油精炼油（四）（四） 反胶团萃取反胶团萃取l1. 反胶团：反胶团：又称反胶束（又称反胶束（Reversed Micelles）l 指指表面活性剂表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连

43、续的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶有机溶剂剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。 反胶团模型反胶团模型亲水基团向内聚集亲水基团向内聚集lp154 2. 表面活性剂及有机溶剂表面活性剂及有机溶剂l 反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。 反胶团萃取原理反胶团萃取原理 l（1）表面活性剂）表面活性剂l 常用：常用： AOT(Aerosol OT)（阴离子表面活（阴离子表面活性剂，琥珀酸性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。乙基己基酯磺酸钠）。l特点：特点：易获得，强

44、度好；极性基团小，形成的易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。进入。 l（2） 非极性有机溶剂非极性有机溶剂 环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。 3. 萃取过程萃取过程第一步：第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相 中，实现对蛋白质的反萃取过程。中，实现对蛋白质的反萃取过程。l4. 优点优点l1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。l2）分离浓缩同时进行

45、，溶剂可反复利用。）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。l3 3）解决胞内酶溶剂萃取环境中迅速失活问题。解决胞内酶溶剂萃取环境中迅速失活问题。l4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。l5）成本低。）成本低。一、膜分离一、膜分离 利用一种特殊的具有选择性透过功能的利用一种特殊的具有选择性透过功能的薄层物质，使流体内的一种或几种物质透过，薄层物质，使流体内的一种或几种物质透过，而其他物质不能够过，从而起到浓缩和分离而其他物质不能够过，从而起到浓缩和分离纯化作用的技术。纯化作用的技术。优点：优点：没有相变，无二次污染，过程简单，没有相变，无二次污染，过程简单，易

46、自动化。易自动化。第二节第二节 酶的精制酶的精制（一）（一） 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析（dialysis）溶质分子溶质分子Y 从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动蛋白质透析蛋白质透析 1. 透析膜透析膜 1）在溶液中形成分子筛多孔薄膜，阻止大分子通过。 2）化学惰性 3）一定的机械强度和良好的再生性能。 商品透析膜大多制成管状商品透析膜大多制成管状 。 材料：纤维素衍生物。材料：纤维素衍生物。1）透析膜的预处理：）透析膜的预处理：蒸馏水洗涤或者乙醇煮沸2）透析袋的保存）透析袋的保存 ：防腐剂冷藏。超滤超滤 (ultrafiltrationultrafilt

47、ration，UFUF ) 超滤原理的示意图超滤原理的示意图 u利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。u超滤膜为非对称膜：超滤膜为非对称膜：1）分离层：薄，具有）分离层：薄，具有一定尺寸孔径，分离作用。一定尺寸孔径，分离作用。2）多孔层：厚，）多孔层：厚，海绵状，支撑作用。海绵状，支撑作用。u超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。中有广泛的应用。u浓度极化：由于小分子溶质通过膜，而大分浓度极化：由于小分子溶质通过膜，而大分子溶质被截留于膜面，渐

48、渐形成浓度梯度。子溶质被截留于膜面，渐渐形成浓度梯度。常规过滤常规过滤(A)(A)和超滤和超滤(B)(B)的示意图的示意图 A AB图图4-61 超滤浓缩装置超滤浓缩装置 l影响流率（一定压力下每分钟通过单位面积膜的液一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量体量）的因素：l1）溶质的分子性质：）溶质的分子性质：比重大的纤维状分子扩散性差比重大的纤维状分子扩散性差l2）溶质浓度：）溶质浓度：l3）压力：）压力：不同溶质选择不同的压力操作不同溶质选择不同的压力操作l4）搅拌：）搅拌：蛋白质对搅拌产生的剪切力敏感蛋白质对搅拌产生的剪切力敏感l5）温度：）温度：一般为低温一般为低温l 层析法也称色谱法，

49、是层析法也称色谱法，是19031903年俄国年俄国植物学家植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。发现并命名的。将植物色素溶液通过装有将植物色素溶液通过装有CaCOCaCO3 3 吸附剂吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。被分开。l 色谱起源色谱起源色谱色谱组分色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组）组成色谱一词（成色谱一词（Chromatography) Chrom

50、atography) 。l 利用混合物中各组分物理化学性质的差利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。动而达到分离的目的。：携带样品流过整个系统的流体：携带样品流过整个系统的流体：静止不动的一相：静止不动的一相l 按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：吸附层析吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。能的差异。

51、分配层析分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。间的分配系数的不同。离子交换层析离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。和力的不同。凝胶层析凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。组分阻滞作用的不同。1. 基本原理基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出

52、层析柱。后流出层析柱。凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水体积外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（的体积（ml）Vi内水体积内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰. K. Kd d=0=0时时, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,说

53、明该组分分子量足够大，不进入微孔，最说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1时时, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。最后流出。. . 其它组分其它组分0K0Kd d1,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。因分子大小而改变洗脱峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。 分配系数分配系数Kd的意义：的意义：1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。可定量地衡量各组分的流出顺序。2) 判断分离效果，判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，差异大，分离效果

54、好， Kd差异小，分离效果差。差异小，分离效果差。2.2.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 1)1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex 型号型号 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G-200 G G 后的数字为凝胶吸水量。数字越后的数字为凝胶吸水量。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。越广。凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小/m/m 溶胀体积溶胀体积/(ml/g)/(ml/g) 分离范围（分离范围（MrMr） Sephadex

55、 G-10Sephadex G-10 Sephadex G-15Sephadex G-15 Sephadex G-25Sephadex G-25 Sephadex G-50Sephadex G-50 Sephadex G-75Sephadex G-75 Sephadex G-100Sephadex G-100 Sephadex G-150Sephadex G-150Sephadex G-200Sephadex G-2004 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2

56、23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.010103 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 43.03.010103 38.08.010104 4 4.04.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 葡聚糖凝胶层析介质的有关参数葡聚糖凝胶层析介质的有关参数 2 2）琼脂糖凝

57、胶（）琼脂糖凝胶（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美国）美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。琼脂糖密度越大，网状结构越密集。型号型号 使用范围（蛋白质的分子量）使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖含琼脂糖（） 6B 6BSepharose 4BSepharose 4B 2B 2B10104 43 310106 610105 53 310107 710106 610108 8 6 64

58、 4 2 2 6B 6BSepharose CL 4BSepharose CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m 0.5m Bio-Gel A 1.5m Bio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m101050050010103 3101015001500101050005000404015000150001001005000050000 1000 1000150000150000 10108 86 64 42 2 1 1 SepharoseSepharose及及Bio-gel A Bio-gel A 型号型号 3 3）聚丙烯酰胺凝

59、胶）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名为商品名为Bio-Gel,Bio-Gel,型号从型号从 Bio-Gel PBio-Gel P2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔径也越大。值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。3. 操作：操作：1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。凝胶介质。（分子质量相差很大，选用交联程度大的凝胶作为介质）

60、 将干胶悬浮于将干胶悬浮于510倍的倍的蒸馏水中蒸馏水中 ，充分，充分溶胀，再用溶胀，再用NaOH-NaCl浸泡浸泡0.5h，用蒸馏水，用蒸馏水洗至中性。洗至中性。2）柱的选择）柱的选择 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速但影响流速。l3）装柱）装柱 干装和湿装干装和湿装l4）流动相对选择：）流动相对选择：平衡时用的平衡时用的buffer一致一致l5）上样）上样l 体积不能过多，不超过床体积的体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时可在，脱盐时可在 10左右。左右。l6）洗脱）洗脱 洗脱液与平衡时用的洗脱液与平衡时用的buffer一致。一致。 洗速不