生物样品中药物定量分析的指导原则与实验实施

1、2015.6.302015.6.30方法学确证是整个药代动力学研究的基础方法学确证是整个药代动力学研究的基础。所有所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性稳定性等研究建立了测定方法，得到了等研究建立了测定方法，得到了标准曲线标准曲线后，后，在检测过程中还应进行在检测过程中还应进行方法学质控方法学质控，制备，制备随行标准随行标准曲线曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可并对质控样品

2、进行测定，以确保检测方法的可靠性靠性。CFDACFDA关于相关生物样品定量分析的要求关于相关生物样品定量分析的要求化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则90129012生物样品定量分析方法验证指导生物样品定量分析方法验证指导原则原则20052005年陆续在相年陆续在相关研究中颁布关研究中颁布中国药典中国药典20152015年版四部年版四部国外相关指导原则国外相关指导原

3、则FDAFDA：Guidance for Industry Bioanalytical Guidance for Industry Bioanalytical Method ValidationMethod ValidationEMEAEMEA：Guideline on bioanalytical method Guideline on bioanalytical method validationvalidation20132013年修订版本年修订版本20122012年版本年版本CFDACFDA1.1. 范围范围2.2. 生物分析生物分析方法验证方法验证2.1 2.1 分析方法的完整验证分析

4、方法的完整验证2.1.1 2.1.1 选择性选择性2.1.2 2.1.2 残留残留2.1.3 2.1.3 定量下限定量下限2.1.4 2.1.4 标准曲线标准曲线2.1.5 2.1.5 准确度准确度2.1.6 2.1.6 精密度精密度2.1.7 2.1.7 稀释可靠性稀释可靠性2.1.8 2.1.8 基质效应基质效应2.1.9 2.1.9 稳定性稳定性2.2 2.2 部分验证部分验证2.3 2.3 交叉验证交叉验证3. 3. 试验样品分析试验样品分析3.1 3.1 分析批分析批3.2 3.2 分析批的接受标准分析批的接受标准3.3 3.3 校正范围校正范围3.4 3.4 试验样品的重新分析和报

5、告值选择试验样品的重新分析和报告值选择3.5 3.5 完整性完整性3.6 3.6 用于评价方法重现性的试验样品再分析用于评价方法重现性的试验样品再分析EMEAEMEA2.1.1 2.1.1 选择性选择性2.1.2 2.1.2 残留残留2.1.3 2.1.3 定量下限定量下限2.1.4 2.1.4 标准曲线标准曲线2.1.5 2.1.5 准确度准确度2.1.6 2.1.6 精密度精密度2.1.7 2.1.7 稀释稀释可靠性可靠性2.1.8 2.1.8 基质效应基质效应2.1.9 2.1.9 稳定性稳定性FDAFDA1. 1. 范围范围测定对象确定测定对象确定生物基质中的药物浓度。生物基质中的药物

6、浓度。适合于非临床或临床试验样品实际分析的基本要求。适合于非临床或临床试验样品实际分析的基本要求。规定规定部分验证部分验证或或交叉验证交叉验证的适用范围。的适用范围。2.1 2.1 完整验证完整验证每个物种和每种基质进行完整验证。每个物种和每种基质进行完整验证。难以获得相同基质，可以采用适当基质替代并给出难以获得相同基质，可以采用适当基质替代并给出理由。理由。完整完整验证包括：验证包括：选择性、定量下限、响应函数和校选择性、定量下限、响应函数和校正范围、准确度、精密度、基质效应、分析物的稳正范围、准确度、精密度、基质效应、分析物的稳定性。定性。对照标准物质对照标准物质对照标准物质的对照标准物质

7、的溶液溶液+ +空白生物基质空白生物基质= =校正标样色谱法需要使用色谱法需要使用内标内标对照标准物质需要提供：对照标准物质需要提供： 分析分析证书、储存条件、失效日期、批号。证书、储存条件、失效日期、批号。内标：内标： 证明可适用，即无干扰。证明可适用，即无干扰。质谱分析推荐使用质谱分析推荐使用同位素内标同位素内标区分目标区分目标分析物分析物和和内标内标与基质的与基质的内源性组分内源性组分或样品或样品中中其他组分（代谢产物或共同服用的其他药物）其他组分（代谢产物或共同服用的其他药物）。6 6个不同来源的空白基质分别分析。个不同来源的空白基质分别分析。如如有干扰有干扰，则干扰的峰面积小于，则干

8、扰的峰面积小于LLOQLLOQ的峰面积的的峰面积的20%20%，小于内标峰面积的，小于内标峰面积的5%5%，可以接受。，可以接受。在新药研究中需要按照要求在报告上提供相应数在新药研究中需要按照要求在报告上提供相应数量的典型色谱图量的典型色谱图J. Wen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43 (2007) 655658如果待测组分是内源性成分？如果待测组分是内源性成分？Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159样品处理用的水及流动相中不含有

9、样品处理用的水及流动相中不含有I I空白生物样品中的空白生物样品中的I I属属于内源性物质于内源性物质空白生物样品标准添空白生物样品标准添加加I I依旧可以测定依旧可以测定n如果待测组分是内源性成分？如果待测组分是内源性成分？添加添加LLOQLLOQ浓度浓度添加添加MQCMQC浓度浓度实测样品实测样品1. 1. 证明处理溶剂（包括流动相）中证明处理溶剂（包括流动相）中未有需要测定的成分未有需要测定的成分2. 2. 证明内源性成分存在测定成分证明内源性成分存在测定成分3. LLOQ3. LLOQ添加图谱显示添加测定成添加图谱显示添加测定成分后，峰面积增加，并辅以数据说分后，峰面积增加，并辅以数据

10、说明（标准曲线）明（标准曲线）Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159如果存在外源性非测定成分影响？（例如中西药合并给药）如果存在外源性非测定成分影响？（例如中西药合并给药）C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 4856空白血浆空白血浆苯丙胺盐酸伪麻黄碱苯海拉明空白血浆空白血浆+ +生姜提取物生姜提取物充分考察同时给药的成分是否会影充分考察同时给药的成分是否会影响待测成分的专一检测响待测成分的专一检测C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 85

11、4 (2007) 48560.5ng/ml0.5ng/ml1.0ng/ml1.0ng/ml4.10 ng/ml4.10 ng/ml14.05 ng/ml14.05 ng/ml空白血浆空白血浆+ +标准样品标准样品给药速效抗晕胶囊后给药速效抗晕胶囊后24h24h血样浓度血样浓度前一前一针进样的残留对后一针进样的干扰。针进样的残留对后一针进样的干扰。一般多发生在高浓度进样后。一般多发生在高浓度进样后。先进一针工作曲线的最高浓度，再紧接着进一针空先进一针工作曲线的最高浓度，再紧接着进一针空白，观察是否有干扰，干扰峰面积白，观察是否有干扰，干扰峰面积小于小于LLOQLLOQ的峰的峰面积的面积的20%2

12、0%，小于内标峰面积的，小于内标峰面积的5%5%，可以接受，可以接受。如干扰，需要消除。如干扰，需要消除。犬血浆中的盐犬血浆中的盐酸克伦特罗的酸克伦特罗的测定测定A.空白样品；空白样品；B.B. 0.1 ng/ml标准标准血浆；血浆；C.进样进样10 ng/ml标标准血浆样品后进准血浆样品后进样的空白样品样的空白样品 残留残留洗针的溶剂、次数；提取溶剂；复溶比例等重新优化能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。可接受的准确度和精密度。是标准曲线的最低点。是标准曲线的最低点。应该满足预期的浓度与实验目的。应该满足预期的浓度与

13、实验目的。准确度应准确度应在标示值的在标示值的+/-20+/-20% %范围范围内。内。变异系数不得超过变异系数不得超过20%20%。指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度。指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度。制备各个浓度的校正标样制备各个浓度的校正标样基质相同。基质相同。每个分析批都应该有一条标准曲线。每个分析批都应该有一条标准曲线。6 6个校正浓度水平个校正浓度水平+ +空白样品空白样品+ +零浓度样品零浓度样品（空白（空白+ +内标）内标）验证中需要评价验证中需要评价3 3条标准曲线。条标准曲线。回回算浓度应该在标示值的算浓度应该在标示值的+/-15%+/-15%，LLOQ+/-

14、20%LLOQ+/-20%之内之内回算浓度偏差回算浓度偏差= =【（实测值标示值）（实测值标示值）/ /标示值标示值】X100%X100%绘制工作曲线评价干扰当线性范围较宽当线性范围较宽的时候，推荐采的时候，推荐采用用加权的方法加权的方法对对标准曲线进行计标准曲线进行计算，以使低浓度算，以使低浓度点计算得比较准点计算得比较准确确。即。即低浓度点低浓度点满足回算的要求。满足回算的要求。权重浓度峰面积比11/x1/x2100.102139.7 117.7 103.6 200.139112.9 102.3 97.6 500.24192.6 88.7 89.5 1000.44393.3 91.7 94

15、.8 2000.86295.3 95.0 99.2 5002.284104.3 104.7 110.1 10004.30999.2 99.8 105.2 INTERCEPT0.04190.051780.06014 SLOPE0.0043010.0042650.00404R20.99910.99910.9942准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近浓度与真实浓度的接近程度。程度。校正标样校正标样绘制工作曲线。绘制工作曲线。质控质控样品样品评估准确度。评估准确度。用用4 4个浓度评价个浓度评价 定量定量下限下限 低浓度低浓度QC

16、QCLLOQLLOQ的的3 3倍以内倍以内 中中浓度浓度QCQC标准曲线中间浓度标准曲线中间浓度 高浓度高浓度QCQC标准曲线上限的标准曲线上限的75%75%二者需要分别配制，二者需要分别配制，即储备液不相同即储备液不相同+/-20%+/-20%+/-15%+/-15%批批内准确度：内准确度：1 1个分析批进行验证个分析批进行验证，每个浓度至少，每个浓度至少5 5个样品。个样品。批批间准确度：间准确度：3 3个个分析批进行验证，且至少进行分析批进行验证，且至少进行两两天天，每个浓度至少，每个浓度至少5 5个样品。个样品。分析物重复测定的接近程度。分析物重复测定的接近程度。测量测量值的相对标准偏

17、差（变异系数）。值的相对标准偏差（变异系数）。采用与准确度验证相同的分析批结果进行计算。采用与准确度验证相同的分析批结果进行计算。4 4个浓度验证。个浓度验证。定量定量下限变异系数不超过下限变异系数不超过20%20%。其余浓度点不超过其余浓度点不超过15%15%。判断样品稀释后是否会影响定量的准确度和精密度。判断样品稀释后是否会影响定量的准确度和精密度。配制高于定量上限浓度的样品。配制高于定量上限浓度的样品。用空白基质稀释该样品。用空白基质稀释该样品。每个稀释因子至少测定每个稀释因子至少测定5 5个数据，其准确度和精密个数据，其准确度和精密度应在度应在+/-15%+/-15%之内。之内。质谱方

18、法应该考察基质效应。质谱方法应该考察基质效应。采用至少采用至少6 6批来自不同供体的基质，不可以合并基批来自不同供体的基质，不可以合并基质。质。选择高、低两个质控浓度进行。选择高、低两个质控浓度进行。求求算不同浓度的基质因子。算不同浓度的基质因子。计算计算内标归一化基质因子内标归一化基质因子= =分析物基质因子分析物基质因子/ /内标内标基质因子基质因子变异系数变异系数15%15%空白血浆沉淀蛋白空白血浆沉淀蛋白标准溶液标准溶液浓度浓度C纯净溶液纯净溶液浓度浓度CQC血浆沉淀蛋白血浆沉淀蛋白浓度浓度CSet 1Set 2Set 3最终进样检测浓度相同最终进样检测浓度相同 基质因子基质因子 10

19、0%Set 2Set 1选择结构类似的化选择结构类似的化合物为内标可以很合物为内标可以很好的消除基质效应好的消除基质效应的影响，应用峰面的影响，应用峰面积比值进行定量，积比值进行定量，其基质效应约为其基质效应约为100%100%分析物基质分析物基质因子因子内标基质内标基质因子因子内标归一化基质内标归一化基质因子因子选择低浓度和高浓度质控样品进行验证。选择低浓度和高浓度质控样品进行验证。预处理后或者在相应条件储存后立即分析得到该条预处理后或者在相应条件储存后立即分析得到该条件下数据。件下数据。制备随行标准曲线，求算上述质控样品的浓度，与制备随行标准曲线，求算上述质控样品的浓度，与标示浓度比较，均

20、值应与标示浓度的偏差在标示浓度比较，均值应与标示浓度的偏差在+/-+/-15%15%之内。之内。【不是比较色谱峰面积不是比较色谱峰面积】稳定性的考察稳定性的考察时间尺度时间尺度应该不小于试验样品的储存时间及应该不小于试验样品的储存时间及相应条件下的处理方式或时间。相应条件下的处理方式或时间。分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性。分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性。基质中分析物冷冻和融化稳定性。基质中分析物冷冻和融化稳定性。基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性。基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性。处理处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性。过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的

21、稳定性。处理处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性。过的样品在自动进样器温度下的稳定性。储存储存前预处理的基质中分析物的稳定性。前预处理的基质中分析物的稳定性。储备液稳定性储备液稳定性：4 4度冰箱或者度冰箱或者-20-20度冰箱度冰箱长期冷冻稳定性长期冷冻稳定性：-20-20度或者度或者-80-80度冰箱度冰箱冻融稳定性冻融稳定性：3 3个冻融循环（冷冻个冻融循环（冷冻8h8h以上）以上）自动进样器稳定性自动进样器稳定性：预处理后放置自动进样器上，：预处理后放置自动进样器上，时间长短与分析批有关时间长短与分析批有关室温稳定性室温稳定性：室温放置的稳定性，与前处理一个分：室温放置的稳定性，与前

22、处理一个分析批有关析批有关采血后全血稳定性采血后全血稳定性：与药物是否易降解有关：与药物是否易降解有关分析方法的转移分析方法的转移仪器的改变仪器的改变校正浓度范围的改变校正浓度范围的改变样品体积的改变样品体积的改变改变基质或者物种改变基质或者物种改变抗凝剂改变抗凝剂改变样品处理步骤改变样品处理步骤改变储存条件改变储存条件CFDACFDA：并未给出如何部分验证，：并未给出如何部分验证，究竟应该选择哪些部分验证，因究竟应该选择哪些部分验证，因此需要自行判断并说明理由。此需要自行判断并说明理由。EMEAEMEA：部分验证可以少到测定：部分验证可以少到测定批间精密度和准确度，也可以至批间精密度和准确度

23、，也可以至几乎全部验证内容。几乎全部验证内容。应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证。相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证。同一同一份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评价均值的差异。价均值的差异。质控质控样品：样品：+/-15%+/-15%以内以内试验样品：试验样品：+/-20%+/-20%以内以内3.1 3.1 分析批分析批空白样品空白样品零浓度样品零浓度样品校正标样校正标

24、样至少至少6 6个（与验证相同）个（与验证相同）质控样品质控样品低、中、高低、中、高3 3个浓度，各个浓度，各2 2份（不少于份（不少于试验样品总数的试验样品总数的5%5%）- -分散处理分散处理试验样品试验样品校正标样：校正标样： 回算浓度偏差在标示值的回算浓度偏差在标示值的+/-15%+/-15%以内。以内。 定量定量下限下限+/-20%+/-20%以内以内 不不少于少于6 6个标样符合上述要求。校正标样越多，需要个标样符合上述要求。校正标样越多，需要75%75%的标样的标样符合符合质控样品：质控样品： 准确度准确度+/-15%+/-15%以内以内 67%67%的质控样品符合的质控样品符合

25、 不不符合的应该不在同一个浓度水平符合的应该不在同一个浓度水平如不符合，重新测试。如不符合，重新测试。试验样品分析浓度范围比验证时候工作曲线试验样品分析浓度范围比验证时候工作曲线窄窄 调整标准曲线范围和质控样品浓度调整标准曲线范围和质控样品浓度 或者加入新的质控样品浓度或者加入新的质控样品浓度试验样品分析试验样品分析浓度浓度高高于定量上限于定量上限 延伸标准曲线范围，增加额外浓度的质延伸标准曲线范围，增加额外浓度的质控控样品样品 或者改变试验样品浓度（稀释）或者改变试验样品浓度（稀释）至少应该有2个质控样品浓度落在试验样品的浓度范围内改变标准曲线，需要改变标准曲线，需要重新进行方法学验证（部分

26、验证）重新进行方法学验证（部分验证）事先制定事先制定SOPSOP确定重新分析的理由和选择报告值的确定重新分析的理由和选择报告值的标准，并在报告中提供重新分析的样品数目及比例。标准，并在报告中提供重新分析的样品数目及比例。主要理由：主要理由： 校正标校正标样或质控样品不合格样或质控样品不合格 内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著 仪器功能异常或者进样不当仪器功能异常或者进样不当 高于定量上限或者低于定量下限高于定量上限或者低于定量下限 空白或安慰剂样品中测到分析物空白或安慰剂样品中测到分析物 色谱图难看色谱图难看不接受由于药不接受由于药

27、动学行为不佳动学行为不佳而重新分析的而重新分析的理由理由在在SOPSOP中应该对中应该对色色谱的谱的积分和重新积分积分和重新积分进行规定。进行规定。任何偏移任何偏移SOPSOP的色谱积分都应该在报告中讨论。的色谱积分都应该在报告中讨论。色色谱积分参数、重新积分参数、初始积分结果和调谱积分参数、重新积分参数、初始积分结果和调整后的积分结果都需要在实验室存档，并备查。整后的积分结果都需要在实验室存档，并备查。在过了若干天后，对试验样品在另外一个分析批进在过了若干天后，对试验样品在另外一个分析批进行重新分析，行重新分析，评价实际样品测定的准确度。评价实际样品测定的准确度。一般重新分析一般重新分析10

28、%10%的样品。的样品。如果样品总数超出如果样品总数超出10001000，则超出部分重新分析，则超出部分重新分析5%5%。建议选择消除相和建议选择消除相和CmaxCmax附近的样品再分析。附近的样品再分析。评价指标评价指标= =（重新测定浓度（重新测定浓度- -初始浓度）初始浓度）/（重新测（重新测定浓度定浓度+ +初始浓度）初始浓度）/2/2* *100%100%至少至少67%67%的复测样品的结果在的复测样品的结果在+/-20%+/-20%之内。之内。以下情况需要再分析：以下情况需要再分析： 毒代动力学，每个物种毒代动力学，每个物种1 1次次 关键性的生物等效性试验关键性的生物等效性试验

29、首次用于人体或者患者的药物试验首次用于人体或者患者的药物试验 首次用于肝肾功能不全患者的药物试验首次用于肝肾功能不全患者的药物试验全部源数据应该以其原始格式保存，并根据要求提全部源数据应该以其原始格式保存，并根据要求提供。供。应记录任何对验证计划的偏离。应记录任何对验证计划的偏离。方法验证报告方法验证报告样品分析报告样品分析报告实验室内部研究一般顺序：实验室内部研究一般顺序：1. 方法的建立和优化方法的建立和优化2. 预实验的样品测试预实验的样品测试3. 制定方法学研究的方案并实施制定方法学研究的方案并实施储备液，工作溶液，系列工作溶液及生物样品溶液的配制储备液，工作溶液，系列工作溶液及生物样

30、品溶液的配制选择性考察、基质效应考察选择性考察、基质效应考察3个分析批次的标准曲线、精密度与准确度考察个分析批次的标准曲线、精密度与准确度考察稳定性考察稳定性考察其他可能的考察其他可能的考察4. 药代动力学实验、取样及样品保存药代动力学实验、取样及样品保存5. 样品测试样品测试+随行标准曲线及随行标准曲线及QC样品样品6. 数据分析数据分析+复测复测7. 数据处理数据处理+出具报告出具报告文献查阅了解相关内容文献查阅了解相关内容1 1. .了解分析对象的理化性质，酸碱性、溶解性、稳定性、了解分析对象的理化性质，酸碱性、溶解性、稳定性、光学性质等。光学性质等。2.2.了解药物的代谢途径、产物和动

31、力学性质，如吸收、了解药物的代谢途径、产物和动力学性质，如吸收、分布、代谢、排泄、结合等。分布、代谢、排泄、结合等。3.3.取样对象：体液，如血、尿等；组织，如肝、脑、胆、取样对象：体液，如血、尿等；组织，如肝、脑、胆、毛发等；细胞等等毛发等；细胞等等4.4.分析的目的：代谢途径和产物，药动学研究，临床药分析的目的：代谢途径和产物，药动学研究，临床药物监测等。物监测等。 HPLCHPLCHPLC-MS/MSHPLC-MS/MS分析物的特点分析物的特点内标的选择内标的选择标准溶液进样分析确定基本色谱条件标准溶液进样分析确定基本色谱条件根据可能的最低浓度确定体外样品能够测定到的最根据可能的最低浓度

32、确定体外样品能够测定到的最低浓度低浓度综合考虑前处理的方法综合考虑前处理的方法液液萃取：干净、可以富集待测成分液液萃取：干净、可以富集待测成分蛋白蛋白沉淀：快速、适合浓度较高的生物样品沉淀：快速、适合浓度较高的生物样品固相固相萃取：纯化效果好、可以富集、适合多成分前萃取：纯化效果好、可以富集、适合多成分前处理（多成分的化合物结构、性质差异较大）处理（多成分的化合物结构、性质差异较大）用校正样品评价选择性和可能的用校正样品评价选择性和可能的LLOQLLOQ评价绝对回收率评价绝对回收率【新的指导原则未提及新的指导原则未提及】预实验预实验一般大鼠选择一般大鼠选择4646只，犬选择只，犬选择2 2只只

33、按照实际试验的要求进行给药取血按照实际试验的要求进行给药取血采用随行标准曲线测定血药浓度采用随行标准曲线测定血药浓度根据预实验结果，确定标准曲线范围，制定分析方根据预实验结果，确定标准曲线范围，制定分析方法学验证的具体内容法学验证的具体内容一般在预实验之后一般在预实验之后进行基质效应、标准曲线、准确度进行基质效应、标准曲线、准确度、精密度的精密度的考察考察（第一天（第一天/ /第二天第二天/ /第三天）第三天）分析批次分析批次11 标准曲线标准曲线1 1，LLOQLLOQ5 5，LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 5分析批次分析批次22 标准曲线标准曲线2 2， LLOQ LLOQ5 5，LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 5 分析批次分析批次33 标准曲线标准曲线3 3， LLOQ LLOQ5 5， LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 53 3个分析批获得个分析批获得3 3条条