蛋白质一级结构测序

1、第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构第三节第三节 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定l一级结构一级结构( (概念和测序）概念和测序）l二级结构二级结构l超二级结构与结构域超二级结构与结构域l三级结构三级结构l四级结构四级结构 蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次什么是什么是PrPr的一级结构？的一级结构？1.定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定： 蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。 一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构2.一级结构的意义一级结构的化学键？一级结构的化学键？P168测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义测定蛋白质

2、氨基酸顺序的重要意义： 测定蛋白质中的测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给出更多的信息。出更多的信息。 为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。限制，顺序测定是必须的。 AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是所以顺序测定是分子病理学分子病理学的一个重要部的一个重要部分。分。 蛋白质中的蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。顺序很能指明它的进化史。胰岛素（胰岛素（insulin insulin ）

3、的一级结构：）的一级结构：胰岛素是动物胰脏胰岛素是动物胰脏细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降低体内血糖含量。要功能是降低体内血糖含量。 牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（RNaseRNase） 一条多肽链，一条多肽链，124AA124AA残基组成，四残基组成，四 个链内二硫键，分子量个链内二硫键，分子量12600.12600.它是测出一它是测出一级结构的第一个酶分子。级结构的第一个酶分子。 1.1.样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）以上） 2.2.知道蛋白质的分子质量，其误差允许在知道蛋白质的分子质量，其误差允许在10%10%左右左右测

4、定蛋白质一级结构的前提测定蛋白质一级结构的前提将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质蛋白质顺序测定基本方法路线测定一级结构的基本方法基本步骤：(1)测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的；(2)拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链。(3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成(4)鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列；(

5、7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质相对分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。2、拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键3、分析每一条多肽链的氨基酸组成 经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。4、鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基 多肽链的另一部分样品进行末端残基的确定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点，方法比较多。5、裂解多肽链成较小的片段酶解法，化学法。 采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成

6、两套或多套肽段，并将其分离。6、测定各肽段的氨基酸序列7、片段重叠法重建完整多肽链一级结构 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。8、确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置 不包括辅基成分分析（二）鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法 肼解法 羧肽酶法 LiBH4还原法N端C端DNFB+NCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHH2NCCR5ONCCR4OHHHHO2NO2NFO2NO2NFNCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHHNCCR5ONC

7、CR4OHHHHHClO2NO2NNCR1HHCOOH+other amino acidsDNP-amino acid(1) Sanger法法 DNFB （二硝基氟苯）反应二硝基氟苯）反应黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定N-未端的测定方法未端的测定方法(2) （DNS法）法）丹磺酰氯反应丹磺酰氯反应-HCl+氨基酸混合物水解水解多肽多肽多肽多肽DNS-DNS-氨基酸氨基酸具有荧光，检测灵敏度高(3)Edman法（苯异硫氰酸脂反应）PITC无无N-N-端氨基的剩余部分端氨基的剩余部分用层析法分离(4) 氨肽酶法从多肽链的从多肽链的N N未端依次向内切未端依次向内切 NHNH2

8、2 -aa-aa-aa-aa. 据一定时间内释放出的据一定时间内释放出的AAAA的数量和种的数量和种类来推测类来推测. .l常用的是亮氨酸氨肽酶（常用的是亮氨酸氨肽酶（LAPLAP）：当）：当N N端端第二个氨基酸是脯氨酸时，第二个氨基酸是脯氨酸时，LAPLAP不能将不能将N N端氨基酸水解下来端氨基酸水解下来 C-未端的测定方法1.肼解法 是目前最好的方法 用色谱法鉴定 多肽与肼在无水条件无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必须烷

9、基化后再肼解。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸3.LiBH4还原法 多肽+ LiBH4 水解 -氨基醇+ n氨基酸含C端氨基酸,用层析法鉴定2. 羧肽酶的方法 是目前最有效也是最常用的方法。 羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨基酸。据一定时间内切下的数量来测氨基酸的数量。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。胰岛素胰岛素 -巯基乙醇巯基乙醇碘乙酸碘乙酸 几条

10、多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂碘乙酸碘乙酸（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。（三）二硫桥的断裂尿素和盐酸胍与蛋白质的尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式可能作用方式：a.a.与肽链竞争氢键与肽链竞争氢键b.b.增加非极性侧链在增加非极性侧链在 水中的溶解度水中的溶解度脲或胍脲或胍（NHNH）脲或胍脲或胍（四）氨基酸组成的分析（四）氨基酸组成的分析氨基酸分析仪进行测氨基酸分析仪进行测定，测定每条多肽链定，测定每条多肽链的的AAAA组成，并计算出组成，并计算出AA

11、AA成分的分子比。成分的分子比。酶解法：如胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶化学法：如溴化氰法 羟胺法（五）裂解多肽链成较小的片段胰蛋白酶胰蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1 R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链（专一侧链（专一性较强，水性较强，水解速度快）。解速度快）。 R R2 2=Pro =Pro 水解水解受抑。受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶糜蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶：或胰凝乳蛋白酶： R R1 1=Phe,Trp,Tyr=Phe,Trp,Tyr时时水解快水解快; ; R R1 1=Leu=Leu，MetM

12、et和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。 R R2 2=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1胃蛋白酶胃蛋白酶 R R1 1和和R R2 2Phe, Trp, Phe, Trp, Tyr; LeuTyr; Leu以及其它以及其它疏水性氨基酸水解疏水性氨基酸水解速度较快。速度较快。 R R1 1=Pro =Pro 水解受抑水解受抑NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 R R2 2=Phe, Trp, Tyr; Leu=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, MetIle,

13、Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。度较快。 R R2 2=Pro=Pro或或GlyGly 水解受抑。水解受抑。 R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 梭梭状状芽孢杆菌中分离，专一性强芽孢杆菌中分离，专一性强 R R1 1=Arg=Arg 。化学法：可获得较大的肽段溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala

14、-之间的肽键。N-N-端分析法端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链特点：能够不断重复循环，将肽链N-N-端端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨基酸残基逐一进行标记和解离。1 1、 （六）肽段氨基酸序列的测定（六）肽段氨基酸序列的测定Edman于于1950年首先提出。年首先提出。顺序分析的顺序分析的最主要的方法最主要的方法PITCPTC-肽肽2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、质谱法（、质谱法（MSMS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快灵敏度高、所需样品少、测定速度快质谱法质谱法(Mass Spectrometry, MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、，即用电

15、场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两就可以确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链4.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法（七）肽段在多肽链中次序的决定重叠肽

16、（重叠肽（overlaping peptide）片段重叠法重建完整多肽链一级结构 片段重叠法重建完整多肽链一级结构 所得资料所得资料： 氨基末端残基氨基末端残基 H 羧基末端残基羧基末端残基 S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS第一套肽段第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS借助重叠法确定肽段次序：（八）确定半胱

17、氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置 蛋白质一级结构的顺序测定完成后，将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次进行专一性的酶解，将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置。 确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置。1 1、采用胃蛋白酶水解：、采用胃蛋白酶水解：切点多，生成的切点多，生成的肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。2、将所得的肽段利用、将所得的肽段利用对角线电

18、泳技术对角线电泳技术进行分离。进行分离。3、然后同其它方法分析的肽段进行比、然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。较，确定二硫键的位置。对角线电泳： 把水解的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。+ +- -

19、+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段二硫键位置的确定二硫键位置的确定（九）蛋白质测序举例（九）蛋白质测序举例 胰岛素测序自学l胰岛素的分子量为胰岛素的分子量为57345734道尔顿，由道尔顿，由5151个氨基酸组成。个氨基酸组成。l含含A A、B B两条链，（两条链，（A A链：链：2121肽肽 ，B B链：链：3030肽肽）。）。 lA A链和链和B B链之间由链之间由两个链间二硫键两个链

20、间二硫键（A7-B7,A20-A7-B7,A20-B19)B19)连接，连接，A A链本身第链本身第6 6位和第位和第1111位的位的2 2个个CysCys残基之残基之间形成一个链内二硫键。间形成一个链内二硫键。（九）蛋白质序列数据库（九）蛋白质序列数据库 60年代中期到年代中期到80年代初，美国国家生物医学研究基金会年代初，美国国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation，简称，简称BNRF) 将搜集到的蛋白质序列和结构信息以将搜集到的蛋白质序列和结构信息以“蛋白质序列和结构地图蛋白质序列和结构地图集集”(Atlas of Prote

21、in Sequence and Structure)的形式发表，的形式发表，主要用来研究蛋白质的进化关系。主要用来研究蛋白质的进化关系。 1984年，年，“蛋白质信息资源蛋白质信息资源”(Protein Information Resource，简称，简称PIR)计划正式启动，蛋白质序列数据库计划正式启动，蛋白质序列数据库PIR也也因此而诞生。因此而诞生。 1988年，美国的年，美国的NBRF、日本的国际蛋白质信息数据库、日本的国际蛋白质信息数据库(Japanese International Protein Information Database，简，简称称JIPID)和德国的慕尼黑蛋白质序列信息中心和德国的慕尼黑蛋白质序列信息中