主要禽病的实验室检测方法及结果分析

1、主要禽病的实验室检测方法及主要禽病的实验室检测方法及结果分析结果分析2（一）血清学检测方法（一）血清学检测方法 1、免疫血清学技术、免疫血清学技术l抗原与抗体在体内（外）均可发生特异性抗原与抗体在体内（外）均可发生特异性结合反应，因为抗体主要来自于血清，在结合反应，因为抗体主要来自于血清，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。或免疫血清学技术。一、常用的实验室检测方法一、常用的实验室检测方法3l血清学反应的一般特点血清学反应的一般特点高度特异性高度特异性反应可逆性反应可逆性反应二阶段性反应二阶段性影响反应的因素影响反应的因素4l血清学反应的

2、应用血清学反应的应用抗原抗体的快速检测抗原抗体的快速检测微生物的鉴定与分析微生物的鉴定与分析生物活性物质的超微定量生物活性物质的超微定量抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位52、血清学反应类型及常用试验方法、血清学反应类型及常用试验方法反应类型反应类型常用试验名称常用试验名称凝集试验凝集试验直接凝集试验直接凝集试验平板凝集试验（平板凝集试验（SPA）血凝（血凝（HA）和血凝抑制试验（）和血凝抑制试验（HI）沉淀试验沉淀试验琼脂免疫扩散试验（琼脂免疫扩散试验（AGP）中和试验中和试验病毒中和试验（病毒中和试验（VN）标记抗体技术标记抗体技术 酶标记技术酶标记技术酶联免疫吸

3、附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）6（1）平板凝集试验（）平板凝集试验（SPA）l基本原理：细菌、红细胞等颗粒状抗原与基本原理：细菌、红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在情况下，产生可相应抗血清在电解质存在情况下，产生可见的颗粒凝集现象。见的颗粒凝集现象。l主要应用：鸡白痢（主要应用：鸡白痢（SP） 支原体（支原体（MG/MS）图图1 1 平板凝集试验检测结果平板凝集试验检测结果8（2）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制试验（）和血凝抑制试验（HI）l基本原理：某些病毒（如基本原理：某些病毒（如NDV）能够凝集）能够凝集特定种类动物的红细胞，此即红细胞凝集特定种类动物的红细胞，此即红细胞

4、凝集现象。这种红细胞凝集现象可以被特异性现象。这种红细胞凝集现象可以被特异性抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。l主要应用：新城疫（主要应用：新城疫（ND） 禽流感（禽流感（AI） 产蛋下降综合症（产蛋下降综合症（EDS） 鸡传染性支气管炎（鸡传染性支气管炎（IB） 图图2 2 血凝抑制试验检测结果血凝抑制试验检测结果G. Cattoli （OIE）10（3）琼脂免疫扩散试验（）琼脂免疫扩散试验（AGP）l基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、细基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质存在电解质存在情况下，

5、产生可见的沉淀物。在情况下，产生可见的沉淀物。l主要应用：鸡马立克氏病病毒（主要应用：鸡马立克氏病病毒（MDV） 鸡痘病毒（鸡痘病毒（FPV）图图3 3 琼脂扩散试验检测结果琼脂扩散试验检测结果1. 1. 抗原；抗原；2. 2. 阳性对照；阳性对照；3-6. 3-6. 待检血清；待检血清；7. 7. 阴性对照阴性对照12（4）病毒中和试验（）病毒中和试验（VN）l基本原理：抗原与相应的抗血清按适当比基本原理：抗原与相应的抗血清按适当比例混合作用后，可被中和而失去感染实验例混合作用后，可被中和而失去感染实验动物、组织细胞或鸡胚的能力。动物、组织细胞或鸡胚的能力。l主要应用：鸡传染性支气管炎病毒（

6、主要应用：鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的血清分型。的血清分型。图图4 4 采用鸡胚接种进行采用鸡胚接种进行IBVIBV分离分离空白对照空白对照病毒接种病毒接种图图5 5 采用中和试验对疑似采用中和试验对疑似IBVIBV分离物进行鉴定与分型分离物进行鉴定与分型空白对照空白对照病毒接种病毒接种病毒病毒+抗血清抗血清15（5）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISA）l基本原理：抗原抗体反应的特异性基本原理：抗原抗体反应的特异性 酶促反应的高效性酶促反应的高效性使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面并使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性；保持其免疫活性；使抗原（或抗体）与

7、某种酶连接成酶标物，这使抗原（或抗体）与某种酶连接成酶标物，这种酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又种酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。保留酶的活性。16l主要应用：多种禽病检测主要应用：多种禽病检测l抗体检测最常用抗体检测最常用ELISA方法：间接法，是利方法：间接法，是利用酶标记的抗抗体（一般为抗鸡用酶标记的抗抗体（一般为抗鸡IgG）检测）检测已与固相抗原结合的抗体。已与固相抗原结合的抗体。图图6 6 间接间接ELISAELISA方法测抗体的基本原理示意图方法测抗体的基本原理示意图18l考虑血清学检测的目的考虑血清学检测的目的l血清样品的采集方法血清样品的采集方法l采集

8、血清样品的数量采集血清样品的数量l血清样品的标记血清样品的标记l血清样品的贮藏及运输血清样品的贮藏及运输3、血清学检测应注意的问题、血清学检测应注意的问题191、病原分离鉴定、病原分离鉴定 （1）定义：指通过人工培养的方法分离出）定义：指通过人工培养的方法分离出病原体的过程。病原体的过程。 （二）病原学检测方法（二）病原学检测方法20（2）病原分离主要目的）病原分离主要目的l进行疾病诊断进行疾病诊断l疾病确诊的黄金方法疾病确诊的黄金方法l病原学研究的基础病原学研究的基础21（3）病原分离方法）病原分离方法l细菌分离培养：各种培养基细菌分离培养：各种培养基l病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种

9、病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种22（4）进行病毒分离应注意的问题）进行病毒分离应注意的问题l样品采集时间样品采集时间l采集样品种类采集样品种类l样品贮藏及运输样品贮藏及运输l常见接种途径常见接种途径l常用鉴定方法常用鉴定方法232、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（PCR）（1）主要目的：通过对特异性基因片段的检）主要目的：通过对特异性基因片段的检测达到检测病原体的目的。测达到检测病原体的目的。（2）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性图图7 7 常规常规RT-PCRRT-PCR检测结果（电泳图）检测结果（电泳图）253、其它病原学检测方法、其它病原学

10、检测方法（1）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制（）和血凝抑制（HI）试验）试验（2）琼脂免疫扩散试验（）琼脂免疫扩散试验（AGP）（3）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISA）（4）胶体金试纸条检测）胶体金试纸条检测（5）动物实验检查）动物实验检查261、雏鸡母源抗体检查（、雏鸡母源抗体检查（1-3日龄）日龄） （1）了解原产地的免疫种类）了解原产地的免疫种类l了解原产地易发病种类及保护性水平了解原产地易发病种类及保护性水平l确定需根据当地情况加免的疫苗确定需根据当地情况加免的疫苗l根据抗体反应追踪是否有过感染根据抗体反应追踪是否有过感染二、实验室监测方案的制定二、实验室监测方案的制定

11、27（2）了解母源抗体水平）了解母源抗体水平l根据母源抗体水平及各种疫病母源抗体半衰根据母源抗体水平及各种疫病母源抗体半衰期合理确定疫苗首免时间期合理确定疫苗首免时间l了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断282、免疫检查、免疫检查 （1）免疫前检查）免疫前检查l目的是了解免前抗体水平、决定免疫时间和目的是了解免前抗体水平、决定免疫时间和进行免疫效果评价。进行免疫效果评价。 初免前检查初免前检查 再免前检查再免前检查29（2）免疫后检查）免疫后检查l目的是检查免疫效果，评价免疫成功或失目的是检查免疫效果，评价免疫成功或失败，尽快采取相应措施确保生产安全。通败，尽快

12、采取相应措施确保生产安全。通常应选择免疫后常应选择免疫后14-21天进行。天进行。30（3）定期检查）定期检查l目的是规律性检查抗体消长水平以便及时目的是规律性检查抗体消长水平以便及时采取补救措施，分析各种免疫之间的相关采取补救措施，分析各种免疫之间的相关性，调整免疫程序。性，调整免疫程序。31（4）重要节点检查）重要节点检查l3050d检查（检查前几次免疫效果）检查（检查前几次免疫效果）l开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求）开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求）l3640W检查（确定抗体水平、适时补免）检查（确定抗体水平、适时补免）323、生产发生变动时的检查、生产发生变动时的检查 （

13、1）日常规律性抗体监测）日常规律性抗体监测l做为发病时检查的参考数据做为发病时检查的参考数据l做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向l做为流行病学分析数据，利于发现病原变异做为流行病学分析数据，利于发现病原变异33（2）双份血清检测）双份血清检测l鉴于发病后抗体常有明显升高，双份血清抗鉴于发病后抗体常有明显升高，双份血清抗体值对比分析有很好的诊断价值。体值对比分析有很好的诊断价值。34（3）抗原检测）抗原检测l某些情况下，抗原检测可以直接证实感染某些情况下，抗原检测可以直接证实感染状况的存在。状况的存在。35（4）未免疫鸡群抗体检测）未免疫鸡群抗体检测l未

14、免疫鸡群某疾病抗体的出现，特别注意雏未免疫鸡群某疾病抗体的出现，特别注意雏鸡母源抗体消失后抗体的再出现以及随日龄鸡母源抗体消失后抗体的再出现以及随日龄增加而抗体持续上升的现象，这对疾病诊断增加而抗体持续上升的现象，这对疾病诊断十分重要。十分重要。364、重要疫病流行动态分析、重要疫病流行动态分析l流行动态分析对生产企业来说，开展具有一定流行动态分析对生产企业来说，开展具有一定的难度，但对重要疫病，尤其是重点进行免疫的难度，但对重要疫病，尤其是重点进行免疫防控的疫病仍然值得重视，对长期的流行资料防控的疫病仍然值得重视，对长期的流行资料进行分析，会得到极为有益的技术支持。进行分析，会得到极为有益的

15、技术支持。37l流行动态分析需要进行大量工作，除抗体监测外，流行动态分析需要进行大量工作，除抗体监测外，必需配合针对性的实验室研究工作，如病原分离必需配合针对性的实验室研究工作，如病原分离鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。381、HI检测结果与分析检测结果与分析 （1）常见）常见HI检测结果检测结果1-3d 15-25d25-35d35-50d50d开产前开产前36w左右左右40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-

16、525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常见检查结果与分析三、重要疫病的常见检查结果与分析图图8 8 种鸡开产前种鸡开产前NDVNDV抗体检测情况抗体检测情况40（2）免疫抗体空档期）免疫抗体空档期l15-25d是母源抗体逐渐消失，新的免疫抗体是母源抗体逐渐消失，新的免疫抗体尚未建立的时期尚未建立的时期l野毒侵袭大多发生于此，一般野毒侵袭大多发生于此，一般18-25d多发多发l空档期随免疫（程序和疫苗）成功达到最短空档期随免疫（程序和疫苗）成功达到最短图图9 NDV9 NDV母源抗体衰减情况母源抗体衰减情况图图10 15-3010 15-30日龄雏鸡日龄雏鸡NDVNDV抗

17、体检测情况抗体检测情况43（3）HI检查的抗体离散度检查的抗体离散度l在在4lg2内是允许范围内是允许范围l大于大于4lg2的基本原因的基本原因初免时母源抗体水平参差不齐初免时母源抗体水平参差不齐免疫成功率不高免疫成功率不高-漏免太多漏免太多疫苗质量不好疫苗质量不好l二免后离散度应达到要求二免后离散度应达到要求44（4）抗体保护临界值）抗体保护临界值l通过攻毒试验加以验证的结果通过攻毒试验加以验证的结果AIV要求要求26NDV要求要求28-10l临界值是针对有效保护对等而言，即疫苗和临界值是针对有效保护对等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相关性。流行毒株有良好的相关性。l当流行毒株变异而疫苗株保

18、护性不足时，原当流行毒株变异而疫苗株保护性不足时，原有临界值在一定程度上失去意义，需要新确有临界值在一定程度上失去意义，需要新确立或提高临界值水平。立或提高临界值水平。45（5）诊断试剂问题）诊断试剂问题l抗原问题：抗原问题：抗原不纯（影响抗原不纯（影响HA的确定）的确定）抗原制备毒株和流行毒株存在明显差异抗原制备毒株和流行毒株存在明显差异l阳性血清问题：阳性血清不纯阳性血清问题：阳性血清不纯46（6）诊断指标）诊断指标lH5N1双份血清检测：应用常规双份血清检测：应用常规 Re-4、Re-5苗免苗免疫情况下，如果知道发病前抗体水平，则疫情况下，如果知道发病前抗体水平，则发病后发病后10-14

19、d可检测出可检测出Re-4、Re-5抗体滴抗体滴度上升度上升22-3。未免相应疫苗的情况下，检测变异株抗体未免相应疫苗的情况下，检测变异株抗体达到达到26-9有诊断价值。有诊断价值。图图11 11 某肉种鸡群发生某肉种鸡群发生H5H5感染前后抗体检测结果感染前后抗体检测结果（38W38W发生，发生，2W2W产蛋率产蛋率75%5%75%5%，死淘，死淘20%20%）图图12 12 某肉种鸡群某肉种鸡群H5H5感染后变异株抗体检测结果感染后变异株抗体检测结果（换羽（换羽24W24W发生，降蛋发生，降蛋10%10%，累计死亡率，累计死亡率5%5%）49lH9N2产蛋鸡发病后产蛋鸡发病后10-14天，

20、天，HI抗体抗体20%以上达到以上达到212以上以上有诊断价值。有诊断价值。雏鸡雏鸡20-30d HI抗体达到抗体达到26-9有诊断价值。有诊断价值。50lND产蛋鸡发病后产蛋鸡发病后10-14d，HI抗体抗体213有诊断价值。有诊断价值。雏鸡雏鸡20-35d HI抗体达到抗体达到26-9有诊断价值。有诊断价值。图图13 13 某肉种鸡群发生某肉种鸡群发生NDVNDV感染后抗体检测结果感染后抗体检测结果52lHI诊断应注意的问题诊断应注意的问题HI诊断应结合临床表现，当临床表现无异常而检测结诊断应结合临床表现，当临床表现无异常而检测结果异常时往往是检测结果出了错，应提高警惕。果异常时往往是检测

21、结果出了错，应提高警惕。532、平板凝集试验（、平板凝集试验（SPA）检测结果与分析）检测结果与分析 （1）可用于）可用于MG、MS、SP检查检查 （2）可进行血清平板和全血平板，相对来说血）可进行血清平板和全血平板，相对来说血清平板更准确和易于判断。清平板更准确和易于判断。54（3）SPA准确率相对较差，假阳性率高，一般群准确率相对较差，假阳性率高，一般群体检查超过体检查超过30%以上阳性才有确实群体感染的诊以上阳性才有确实群体感染的诊断意义。断意义。（4）国内产品和国外产品特异性上有一定差距。）国内产品和国外产品特异性上有一定差距。553、琼脂扩散试验（、琼脂扩散试验（AGP）检测结果与分

22、析）检测结果与分析 （1）可用于）可用于MD、POX和和IC （2）对）对MD可进行抗体、抗原两种检测可进行抗体、抗原两种检测l50d左右，左右，50%以上抗体阳性预示疫苗反应正常以上抗体阳性预示疫苗反应正常l用羽髓做琼扩有发病诊断价值用羽髓做琼扩有发病诊断价值56（3）POX常不用检测，通过观察接种部位反应可常不用检测，通过观察接种部位反应可了解免疫效果，观察临床症状进行疫病诊断。了解免疫效果，观察临床症状进行疫病诊断。（4）IC的琼扩试剂很少，可从国外进口或选用日的琼扩试剂很少，可从国外进口或选用日本北里所的间接血凝试剂。本北里所的间接血凝试剂。574、ELISA检测结果与分析检测结果与分析 （1）目前可应用）目前可应用ELISA检测的疾病检测的疾病lND、AI lMG、MS、SPlIB、IBD、REO、AE、 RE、ILT、CIAlALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag58（2）常见）常见ELISA检测结果检测结果1-3d15-25d25-35d50d开产前开产前产蛋期产蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004