分子细胞生物学技术

1、李特 细胞生物学杂交瘤技术杂交瘤技术（hybridoma techniquehybridoma technique）杂交瘤技术杂交瘤技术 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有合成和分泌特异性抗体的特点。原理： 细胞的选择与融合 选择培养基的应用(一)细胞的选择与融合 融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。 融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤

2、细胞才具备这种特性。 选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。 聚乙二醇(PEG1 0002 000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。(二)选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理学过程，在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现：脾细胞 瘤细胞 脾细胞/瘤细胞 脾细胞/脾细胞 瘤细胞/瘤细胞正常的脾细胞在培养基中仅存活57d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除细胞DNA合成一般有两条途径：从头合成途径：甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断

3、瘤细胞利用正常途径合成DNA；另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。 HAT培养基培养细胞混合液7-10天： 在用HAT选择培养12天内，将有大量瘤细胞死亡，34天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持710天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。杂交瘤的克隆化杂交瘤克隆化一般是

4、指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。1有限稀释法克隆2软琼脂培养法克隆单抗大量制备方法 （1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。 （2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按13107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后（一般1020天）则可采血，从血清中获得单克隆腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水单克隆抗体的鉴定