微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用(虬-徐 伟 东

1、上海市食品药品检验所上海市食品药品检验所2021年年5月月27徐徐 伟伟 东东微生物鉴定技术在药品检验微生物鉴定技术在药品检验和监管中的应用和监管中的应用微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一一、背景介绍一、背景介绍v 在在1993-1998年间，美国年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召报告的由微生物污染引起的召回案件到达回案件到达1370件，占所有产品召回案件的件

2、，占所有产品召回案件的36%v 我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。v 药品平安管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢药品平安管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到微生物污染微生物污染v 我国各大城市不断承办国际

3、大型体育赛事和国际会议尤其是我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是2021年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。品的监督管理水平的要求。 对微生物分类水平较低，只能鉴定对微生物分类水平较低，只能鉴定到到“属，鉴定微生物种类有限属，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限分子方法分子方法v 分子生物学技术研究的是分子生物学技术研究的是微生物微生物DNA序列信息，常序列信息，常用于细菌分类的用于细菌分类的16S r DNA也有也有1500个碱基，个碱基，每个碱基位置由每个碱基位

4、置由ATGC四四种核苷酸中的一种组成，种核苷酸中的一种组成，多样性可达种可能约多样性可达种可能约10900。v 新版的新版的?伯杰氏系统细菌学伯杰氏系统细菌学手册手册?微生物微生物DNA变异信变异信息为主息为主 传统方法传统方法v 人类的土壤微生物已到达人类的土壤微生物已到达10万种万种 v 现在常用的微生物鉴定用生现在常用的微生物鉴定用生化反响只有化反响只有20多种，实际多种，实际经过研究形成一致标准的、经过研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅有意义的生化鉴定结果仅2000多种。多种。 v 微生物生化鉴定金标准的微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统鉴定系统仅能鉴定仅能鉴定550种细菌种

5、细菌v 通过碳源利用进行微生物鉴通过碳源利用进行微生物鉴定的定的Biolog系统也仅能鉴系统也仅能鉴定定2000种微生物种微生物 微生物变异能力强，生化反响准确微生物变异能力强，生化反响准确度不高，错检漏检现象普遍度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限v 生化反响鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的生化反响鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属属微生物的酶系统根本相同，可以到达鉴定的目的微微生物的

6、酶系统根本相同，可以到达鉴定的目的微生物生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生突变能力强，如果这些突变点涉及到微生物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，导致鉴定失败导致鉴定失败 v 在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反响才会在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反响才会被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反响的微生物被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反响的微生物那么被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关那么被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄色

7、葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄黄色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、社区食物中毒的重要污染源。社区食物中毒的重要污染源。 不能对微生物污染进行准确溯源分析不能对微生物污染进行准确溯源分析传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限v 在进化过程中生物在进化过程中生物DNA分子会形成大量分子会形成大量DNA多态性多态性区域和非编码区域和非编码DNA序列。序列。 不会造成生物种属归类争议不会造成生物种属归类争议 也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变

8、 通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是微生物种内差异的来源微生物种内差异的来源v 如常用于真菌种类鉴定的如常用于真菌种类鉴定的ITS基因基因v ITS片段能保持相对稳定的变异频率片段能保持相对稳定的变异频率v 亲缘关系非常接近的亲缘关系非常接近的2个种都能在个种都能在ITS序列上表现出序列上表现出差异，显示最近的进化特征差异，显示最近的进化特征微生物鉴定技术平台的建设

9、微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较革兰氏染色镜鉴革兰氏染色镜鉴按照标准进行按照标准进行传统的生化反响鉴定传统的生化反响鉴定API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准 半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪ATB Expression 全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（VITEK 2）微生物鉴定手

10、段微生物鉴定手段 Mini VIDAS筛选系统筛选系统免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀实验免疫沉淀实验微生物检测手段微生物检测手段荧光定量荧光定量PCR(BAX)色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术 传统筛选方法传统筛选方法2.1 技术手段技术手段PCR基因分型基因分型分子杂交分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定阳性菌分子水平上的鉴定12341.形态学鉴定形态学鉴定3.核糖体水平上核糖体水平上的鉴定的鉴定APIVITEK16S rDNA序列分析序列分析分子杂交分子杂交Dupont RiboPrinter2.生化鉴定生化鉴定傅里叶红外光谱傅里叶红外光谱Rep-PCR (Diver

11、siLab)4.全基因组水平上全基因组水平上的鉴定的鉴定5.脉冲场电泳技术脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序多位点序列分析列分析(MLST),多多位点重复串联序列位点重复串联序列分析分析(MLVA),随机扩随机扩增多态性分析技术增多态性分析技术RAPD)API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定，为低本钱替代传统手工细菌生化鉴定的最正确产定，为低本钱替代传统手工细菌生化鉴定的最正确产品。品。特点：特点：完整的鉴定谱：完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于种试条，可鉴定的细菌多于550种种简单

12、方便：标准化方法，本钱低廉，判读结果简单简单方便：标准化方法，本钱低廉，判读结果简单快速结果：快速结果：4-24小时。小时。半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪ATB Expression检测工程：可鉴定由环境、原料及制成品别离出的菌检测工程：可鉴定由环境、原料及制成品别离出的菌种和药敏试验包括：肠杆菌、非发酵种和药敏试验包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌。可鉴定葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌。可鉴定770种细菌和分析近种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。种抗生素药敏实验。v 原理：鉴定试条包含风干底物的反响孔，经标准浊原理：鉴定试条包含风干底物的反响孔，经标准

13、浊度的菌液活化，于指定温度培养度的菌液活化，于指定温度培养4小时小时/24小时后小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的比较，以客观的2个参数鉴定百分率及个参数鉴定百分率及T-值计值计算鉴定结果算鉴定结果v 特点：特点：v 速度快捷速度快捷ATB Expression提供自动化接种，阅提供自动化接种，阅读及分析试条结果。读及分析试条结果。v 准确可靠的结果

14、准确可靠的结果ID 32及快速及快速ID 32 试条由金牌试条由金牌标准标准API试条改进而成，配合自动化概念，结合成试条改进而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统完整的细菌鉴定系统全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪VITEK 2检测工程：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计检测工程：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比方革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性了不同的鉴定卡片，比方革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，种细菌，70多种药物多种药物约约50多种药物组合的药敏卡。多种药物组合的药敏卡。v 原理：仪器的原理其实就是我

15、们进行细菌鉴定中使用原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反响。仪器把的生化反响。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反个对细菌鉴定必需的生化反响培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色响培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反响进行判断，利用数值法进行判定。反响进行判断，利用数值法进行判定。v 特点：特点：v 快速：鉴定结果平均只需快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细小时。对与快速生长细菌菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等等)鉴定可提前到鉴定可提前到2小时。小时。v 操作简便：全部操作自动化，简单而方便操

16、作简便：全部操作自动化，简单而方便v 资料处理：资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室资料软件集中管理实验室资料v 获得获得AOAC 国际认证：保证提供的微生物鉴定结果国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的是公认的全自动荧光免疫分析仪全自动荧光免疫分析仪(mini-VIDAS) 检测工程：食品及环境中最常见致病性细菌李斯特检测工程：食品及环境中最常见致病性细菌李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠杆菌菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠杆菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测的快速筛检。沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测的快速筛检。v 原理：原理： 以免疫技术捕获目标微生

17、物，应用酶联免疫法，以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光最后测蓝色荧光ELFA。包被针上有抗体包被，。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。v 特点：特点：v 结果准确：对每个标本做两次免疫反响，保证结果的结果准确：对每个标本做两次免疫反响，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美倍。已获得美国国FDA、日本厚生省、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。商品检验局等政府及权威机构认可。v 可同时进行可同时进行12个相同或不同

18、的测试。每天进行约个相同或不同的测试。每天进行约6080项测试项测试v 特异性强：标本不需别离出目标微生物即可上机检测。特异性强：标本不需别离出目标微生物即可上机检测。v 防止交叉污染：没有采样针，防止标本之间交叉污染；防止交叉污染：没有采样针，防止标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染绝了标本对环境的污染v 全自动化、操作简便全自动化、操作简便荧光定量荧光定量PCR聚合酶链式反响技术聚合酶链式反响技术PCR是分子生物学技术最具有是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物代表性的技术

19、。它是一种能在体外将微量生物DNA分子分子进行数百万倍放大的新型检测技术。进行数百万倍放大的新型检测技术。荧光定量荧光定量PCR技术在普通技术在普通PCR技术根底上，通过荧光染技术根底上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰因素，克服了普通因素，克服了普通PCR易污染的问题，除去样品前增菌易污染的问题，除去样品前增菌时间，时间，5小时内可得到

20、检测结果。小时内可得到检测结果。微生物检测限可能到微生物检测限可能到达达1 CFU/mL以下，以下，而且抗杂菌干扰能力而且抗杂菌干扰能力强强DNA测序技术测序技术u DNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息u 如细菌的如细菌的16S r DNA和真菌的和真菌的ITS序列，已经被广序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于DNA测序测序方法耗时短，准

21、确度高，在细菌、真菌、植物、方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来越广泛的应用越广泛的应用a) 微生物污染溯源分析微生物污染溯源分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标准方法准方法现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的研物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘

22、关系的研究中显示出广泛的应用前景究中显示出广泛的应用前景 b) 相似微生物相似微生物DNA序列比对和微生物进化分析序列比对和微生物进化分析根据生物根据生物DNA序列的特异性分析，可检测生物基因的微序列的特异性分析，可检测生物基因的微小变化，监控和预测微生物污染的爆发小变化，监控和预测微生物污染的爆发16S rDNA分型已被广泛认可，微生物分型已被广泛认可，微生物16S rDNA进化树进化树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范围宽，开展前景广，开展潜

23、力巨大围宽，开展前景广，开展潜力巨大指纹图谱技术指纹图谱技术分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组基因组DNA进行酶消化，通过特异性探进行酶消化，通过特异性探针与目标针与目标DNA序列的杂交结合，经过转序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。现有成熟的基于图谱。现有成熟的基于16S r DNA的分子的分子杂技图谱库涵盖了杂技图谱库涵盖了200个属的个属的1200多种多种6950株微生物，为各研究和实验机构提株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。为环境供了一个统一的微生物分型

24、标准。为环境别离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、别离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体和任何细菌建立了一个全自动有益生物体和任何细菌建立了一个全自动的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微生物环境进行控制及流行病学调对所有微生物环境进行控制及流行病学调查等强大功能。查等强大功能。近红外傅立叶光谱分析近红外傅立叶光谱分析色谱分析色谱分析物质成分分析物质成分分析红外傅立叶光谱分析红外傅立叶光谱分析 FT-IR技术以未损伤细胞的技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为根光

25、谱的特殊指纹区为根底，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就底，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征是蛋白质、核酸等物质的特征 由于这些细胞组分与基因表达有关，反响了全细胞组分由于这些细胞组分与基因表达有关，反响了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差异息，从而区分生化信息上的差异德国德国Bruker公司微生物公司微生物FT-IR分析分析用户手册主要采用用户手册主要采用1200-900-1，3000-2800-1，1500-1400-1谱段组合进行微生物判别分析

26、，谱段组合进行微生物判别分析，这这3个谱段分别主要代表了微生物个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。信息。色谱分析色谱分析 微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关有种属特征或与其分类位置密切相关 通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径鉴定的新途径 高效液相色谱高效液相色谱(High - perf

27、ormance liquid chromatography，HPLC) 气相色谱气相色谱(Gas chromatography，GC) 气相色谱质谱联用气相色谱质谱联用(Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS) 液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用(LC-MS/MS)建立各种生物标志物在微生物中分布情况建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向色谱分析微生物的主要方向2.1 技术手段技术手段2.2 方法比较方法比较各种鉴定方法的比较各种鉴定方法的比较我所抗生

28、素室通过比较分析近百我所抗生素室通过比较分析近百种微生物的生化鉴定方法种微生物的生化鉴定方法API和和VITEK 2鉴定和分子生物学鉴定和分子生物学方法鉴定方法，客观准确的多方方法鉴定方法，客观准确的多方面评价各种方法的优劣面评价各种方法的优劣微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源分析3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源

29、分析3.1 细菌鉴定细菌鉴定3.2 溯源分析溯源分析微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检

30、测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据

31、政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4v微生物检测实验室应首先确保实验室的设施和微生物检测实验室应首先确保实验室的设施和环境不会对检验过程带来微生物污染环境不会对检验过程带来微生物污染v只有

32、排除检测过程中的微生物污染，才能保证只有排除检测过程中的微生物污染，才能保证检验结果的准确性，才能有足够的理由相信，检验结果的准确性，才能有足够的理由相信，样品污染来自药品本身，而不在检验过程中被样品污染来自药品本身，而不在检验过程中被污染的污染的v对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样品检测更加重要品检测更加重要四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 公正公正准确准确科学科学高效高效v加强检测的“过程控制v建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被

33、动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。v如果样品检验过程中不合格，别离鉴定样品中的微生物，与环境微生物数据库比较、分析微生物污染来源，出具客观的检测报告，杜绝实验结果假阳性和假阴性的发生样品接收样品接收样品摆放样品摆放样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告登记样品名称，检查是否具有唯一性登记样品名称，检查是否具有唯一性标识，并检查是否与运转表内容一致标识，并检查是否与运转表内容一致看样品外包装是否完整、密封看样品外包装是否完整、密封,是否能是否能保持无菌状态符合检验要求保持无菌状态符合检验要求样品数量是否符合检验要求样品数量是否符合检验要求样品接收样品接收原

34、始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过程控制样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告 根据样品的贮存条件进行冷藏、冷冻根据样品的贮存条件进行冷藏、冷冻或常温放置或常温放置 将样品分区域在检、待检、检毕将样品分区域在检、待检、检毕摆置摆置冰箱和冰柜的温度记录冰箱和冰柜的温度记录样品摆放样品摆放样品摆放样品接收样品接收原始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过程控制环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告环境和设施等的质量管理环境和设施等的质量管理仪器状态是否正常是否在计量标志仪器状态是否正常是否在计量标志的有效期内

35、的有效期内做好仪器使用记录做好仪器使用记录仪器设施环境样品接收样品接收样品摆放样品摆放样品分发样品分发原始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过程控制样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告 核对质量标准是否现行有效核对质量标准是否现行有效 培养基的质量评估工作的审查培养基的质量评估工作的审查 关键步骤用试剂的质量控制关键步骤用试剂的质量控制 阳性对照菌的管理阳性对照菌的管理 留样管理留样管理 废弃物管理废弃物管理 对灭菌效果评价的审查对灭菌效果评价的审查 实验过程质量控制管理人员技术能力，方法比对实验过程质量控制管理人员技术能力，方法比对实验，

36、人员比对实验，制备质控样品加菌随行检查实验，人员比对实验，制备质控样品加菌随行检查 应急事件处理程序应急事件处理程序实验过程样品接收样品接收样品摆放样品摆放原始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过程控制样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告完全按完全按SOP书写，所写即所做的内容书写，所写即所做的内容统一原始记录的格式和内容统一原始记录的格式和内容按既定期限完成原始记录的书写按既定期限完成原始记录的书写按不同来源分别输入结果按不同来源分别输入结果原始记录样品接收样品接收样品摆放样品摆放原始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过

37、程控制样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告原始记录的完整性原始记录的完整性检验数据的正确性检验数据的正确性结果判断的合理性结果判断的合理性原始记录审核样品接收样品接收样品摆放样品摆放原始记录审核原始记录审核原始记录原始记录检测过程控制检测过程控制样品分发样品分发环境环境设施设施仪器仪器实验过程实验过程结果报告结果报告 阴性结果直接报告阴性结果直接报告 阳性结果阳性结果鉴定鉴定结果报告结果报告样品接收样品接收样品摆放样品摆放原始记录原始记录原始记录审核原始记录审核检测过程控制检测过程控制 建立环境微生物菌株信息库建立环境微生物菌株信息库 实验室洁净环境微生物监

38、控实验室洁净环境微生物监控头状葡萄球菌头状葡萄球菌Staphylococcus capitis溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus缓症链球菌缓症链球菌Streptococcus mitis科氏葡萄球菌科氏葡萄球菌Staphylococcus cohnii藤黄微球菌藤黄微球菌Micrococcus luteus常见洁净环境微生物污染常见洁净环境微生物污染 实验室洁净环境微生物监控实验室洁净环境微生物监控v 建立实验室洁净区采样方案建立实验室洁净区采样方案v ?医药工业洁净室区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法医药工业洁净室区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试

39、方法?GB/T 16292162941996v ?药品生产质量管理标准药品生产质量管理标准?1998v 以一个月为周期，连续监测实验室环境以一个月为周期，连续监测实验室环境v 不定期对无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种不定期对无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种群和分布数据群和分布数据检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、表面微生物检测和操作人员卫生检测等表面微生物检测和操作人员卫生检测等v 在实验环境中以葡萄球菌属在实验环境中以葡萄球菌属Staphylococcus别离数目最多别离数目最多为为34%v 微球菌属微球菌属Microco

40、ccus和芽孢杆菌属和芽孢杆菌属Bacillus次之，次之，分别为分别为19.15%和和17.04%v 假单胞菌属假单胞菌属Micrococcus、莫拉菌群、莫拉菌群Moraxella、短、短波单胞菌属波单胞菌属Brevundimonas占占4.26%v 短杆菌属短杆菌属Brevibacterium、不动杆菌属、不动杆菌属Acinetobacter、鞘氨醇单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、泛菌属泛菌属Pantoea等所占比例归于其他项中等所占比例归于其他项中v 收集的环境微生物中酵母菌占收集的环境微生物中酵母菌占8.51%，主要为近平滑假丝酵母，主要为近平滑假丝酵母Candid

41、a parapsilosis和粘红酵母和粘红酵母Rhodotorula mucilaginosav 霉菌等丝状真菌占霉菌等丝状真菌占4.26%，主要为青霉菌属，主要为青霉菌属 我所实验室洁净环境微生物监控我所实验室洁净环境微生物监控 我所环境微生物菌株信息库的建立我所环境微生物菌株信息库的建立我们连续三个月对实验室洁净环境中我们连续三个月对实验室洁净环境中局部环境微生物进行追踪，并进行同局部环境微生物进行追踪，并进行同源性分析源性分析以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到16株葡萄球球菌属细菌。株葡萄球球菌属细菌。7、8月分别收集到的细菌月分别收集到的细菌239与

42、与250和和232与与246之间同源性较高，之间同源性较高，归在一个子类中，属于同源污染。归在一个子类中，属于同源污染。说明说明7月和月和8月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒漏洞。月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒漏洞。经过消毒，在经过消毒，在9月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未发现有和前两月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未发现有和前两月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，9月份收集到的局部葡月份收集到的局部葡萄球菌为新进入环境的微生物。萄球菌为新进入环境的微生物。同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度重视仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染

43、的作用要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全面调查建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回忆调查，帮助质量体系的改进。微生物进行鉴定菌株来源微生物进行鉴定菌株来源共241株四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境

44、监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4 在药品微生物检验中的应用在药品微生物检验中的应用v 在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复合和监控。通过比照环境监测的微生物种群类别

45、和合和监控。通过比照环境监测的微生物种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增菌检验报告的含金量。增菌检验报告的含金量。 在细菌污染检查中的应用在细菌污染检查中的应用分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16S rDNA 序列16S rDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色API鉴定形态鉴定生化鉴定VITEK鉴定细菌的鉴定流程图细菌的鉴定流程图 在真菌污染检查中的应用在真菌污染检查中的应用 在真菌污染检查中的应用在真菌污染检查中的应用v 现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数现行国

46、标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几个种属的霉菌进行鉴定。几个种属的霉菌进行鉴定。v 我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌的鉴定需要在别离纯化后培养菌的鉴定需要在别离纯化后培养12-14天，再对其孢天，再对其孢子及菌丝进行形态学观察。子及菌丝进行形态学观察。v 真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境和检验人员平安具有潜在污染风险。境和检验人员平安具有潜在污染风险。分子生物学鉴定技术有效的解决了区分污染来源的分子生物学鉴定技术有效的解决了区分污染来源的问题。该方法不需要使用选择

47、性培养基，纯化后即问题。该方法不需要使用选择性培养基，纯化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进行行DNA的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验室工作环境带来的潜在污染危害室工作环境带来的潜在污染危害真菌的鉴定流程图真菌的鉴定流程图分离纯化得到真菌样品的单菌落真菌菌落形态观察真菌DNA的提取构建系统发育树分子生物学评价通用引物扩增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中进行Blast分析鉴定结论四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数

48、据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4美国美国FDA在要求药厂将微生物鉴定到在要求

49、药厂将微生物鉴定到“种一级，并种一级，并建议在微生物形态和生化反响鉴定之外采用基因分型建议在微生物形态和生化反响鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控控对药厂生产环境监管和风险评估上应用对药厂生产环境监管和风险评估上应用 上海某药业产品受微生物潜在污染风险上海某药业产品受微生物潜在污染风险 上海某药业无菌产品微生物污染溯源上海某药业无菌产品微生物污染溯源 某医疗器材灭菌方法研究某医疗器材灭菌方法研究对药厂生产环境监管和风险评估上应用对药厂生产环境监管和风险评估上应用某制药厂沉降菌同源性分析某制药厂沉降菌同源性分析检测实

50、验室检测实验室微生物信息库微生物信息库制药企业制药企业微生物信息库微生物信息库同同源源性性分分析析比比对对污染源污染源是是否否微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 鉴鉴 定定四、四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用微生物鉴定技术平台建设的意义及运用 增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力检测结果公

51、信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.44.4 应用范围广，扩展能力强，可进行产应用范围广，扩展能力强，可进行产品真伪鉴别和致敏原检测品真伪鉴别和致敏原检测v 国际上普遍加强了有关食品标签的法律法规，对相关标准不断国际上普遍加强了有关食品标签的法律法规，对相关标准不断细化。越来越多国家和地区开始全面实施对食品致敏原成分加细化。越来越多国家和地区开始全面实施对食品致敏

52、原成分加以标识的规定以标识的规定 酶联免疫技术酶联免疫技术 PCR技术等技术等v 动植物产品的真伪鉴定动植物产品的真伪鉴定 追踪产品产地追踪产品产地 鉴别产品主要组成成分鉴别产品主要组成成分微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一企业自查企业自查政府监管政府监管微生物样本的采集微生物样本的采集微生物菌株鉴定微生物菌株鉴定企业环境控制及污企业环境控制及污染溯源能力染溯源能力新

53、型监管模式的建立新型监管模式的建立构建微生物分布图构建微生物分布图建立菌种信息库建立菌种信息库A类企业：分子水平类企业：分子水平B类企业：生化水平类企业：生化水平C类企业：境检、类企业：境检、API水平水平 企业微生物鉴定到企业微生物鉴定到“属属 药检所鉴定到药检所鉴定到“种种 “菌珠菌珠五、上海医药企业微生物污染的监督、管理和风险评估新模五、上海医药企业微生物污染的监督、管理和风险评估新模式的建立新的监管模式流程图式的建立新的监管模式流程图 新的监管模式流程图新的监管模式流程图食品药品监督管理局科学规划食品药品监督管理局科学规划企业内部自查企业内部自查局各职能部门外部督察局各职能部门外部督察

54、药检所强大的技术支撑药检所强大的技术支撑 上海医药企业微生物污染的信息库上海医药企业微生物污染的信息库监督、管理和风险评估监督、管理和风险评估完善对制药企业的风险分级监管完善对制药企业的风险分级监管建立和健全日常监督检查方法建立和健全日常监督检查方法强化企业微生物风险管理意识强化企业微生物风险管理意识建立药品污染源通报、追踪平台，完善药品召回机制建立药品污染源通报、追踪平台，完善药品召回机制5.15.25.35.4帮助企业改进产品质量，打造医药平安公共研发平台帮助企业改进产品质量，打造医药平安公共研发平台5.5五、五、上海上海医药企业微生物污染的监督、管理和风医药企业微生物污染的监督、管理和风

55、险评估新模式的建立险评估新模式的建立5.1 完善对制药企业的风险分级监管完善对制药企业的风险分级监管v 对制药企业分级管理往往依据药品对制药企业分级管理往往依据药品的产量、使用频次及以往的污染事的产量、使用频次及以往的污染事件严重性，对生产工艺和生产环境件严重性，对生产工艺和生产环境缺乏有效的数据监测，容易忽略潜缺乏有效的数据监测，容易忽略潜在的微生物污染危害在的微生物污染危害v 要是对文件资料的审查和经验性的要是对文件资料的审查和经验性的对加工条件和过程的评判，缺乏对对加工条件和过程的评判，缺乏对微生物污染进行监控和调查的手段，微生物污染进行监控和调查的手段，仅能对生产环境和终产品的细菌总仅

56、能对生产环境和终产品的细菌总数和控制菌进行检查，缺乏量化的数和控制菌进行检查，缺乏量化的评价指标评价指标v 检测机构对微生物检测和追踪识别检测机构对微生物检测和追踪识别能力大幅提高能力大幅提高v 通过采用微生物鉴定和分型技术对通过采用微生物鉴定和分型技术对药品加工全过程的监控，能对微生药品加工全过程的监控，能对微生物污染来源进行详细的分析，绘制物污染来源进行详细的分析，绘制工厂微生物分布图，了解工厂生产工厂微生物分布图，了解工厂生产过程中的污染重灾区和引起污染的过程中的污染重灾区和引起污染的工艺步骤工艺步骤v 为建立更全面的药品质量体系和风为建立更全面的药品质量体系和风险管理体系提供了有效的分

57、析手段。险管理体系提供了有效的分析手段。增强了监管部门对制药企业的监管增强了监管部门对制药企业的监管力度和检查能力力度和检查能力传统监管方法传统监管方法新新监管方法监管方法v 上海共有制药企业约上海共有制药企业约200家家v 上海地区被列为重点监控对象的注射剂、生物制品和特殊药品上海地区被列为重点监控对象的注射剂、生物制品和特殊药品三类高风险品种的三类高风险品种的生产企业仅有生产企业仅有58家家将临时性的整顿深化为常态性的管理，可以使监管将临时性的整顿深化为常态性的管理，可以使监管部门快速应对微生物性污染突发事件，为有效评估部门快速应对微生物性污染突发事件，为有效评估污染源的危害和范围提供详尽

58、的第一手分析资料污染源的危害和范围提供详尽的第一手分析资料这些品种涉及范这些品种涉及范围广、产品使用围广、产品使用频繁，且容易发频繁，且容易发生微生物性药品生微生物性药品污染事件。污染事件。逐步提高上海地逐步提高上海地区制药企业的微区制药企业的微生物性污染的风生物性污染的风险管理水平。险管理水平。上海地区高危企业上海地区高危企业微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考 1、 调研：掌握企业生产管理水平和微生物风险管理调研：掌握企业生产管理水平和微生物风险管理能力能力 企业根本情况调查企业根本情况调查 微生物污染情况现场调查微生物污染情况现场调查 企业微生物风险管理水平等级划分企业微生物

59、风险管理水平等级划分 制订适合处于不同风险理水平制药企业管理措施和制订适合处于不同风险理水平制药企业管理措施和改进意见改进意见 2 、完善药品微生物污染风险管理体系，制定切实可、完善药品微生物污染风险管理体系，制定切实可行的日常微生物监控网和风险防范、预警机制。行的日常微生物监控网和风险防范、预警机制。 对制药企业微生物污染的控制相关从业人员进行有方对制药企业微生物污染的控制相关从业人员进行有方案的指导和培训案的指导和培训 为各类企业设定微生物风险控制水平目标，帮助企业为各类企业设定微生物风险控制水平目标，帮助企业建立微生物自查、预警和防护体系建立微生物自查、预警和防护体系 建设微生物污染监控

60、数据库，为药品监管部门提供监建设微生物污染监控数据库，为药品监管部门提供监管依据，建立药品平安监管长效机制管依据，建立药品平安监管长效机制对有条件的对有条件的A类企业：要具备一定的分子生物学鉴定方法和类企业：要具备一定的分子生物学鉴定方法和完备的生化鉴定手段，能对环境微生物给出根本准确度鉴完备的生化鉴定手段，能对环境微生物给出根本准确度鉴定结果；定结果；对对B类企业：要具备完善的生化鉴定体系，要能给出可靠的类企业：要具备完善的生化鉴定体系，要能给出可靠的微生物生化谱；微生物生化谱；对对C类企业：根本要具有类企业：根本要具有API试剂条鉴定条件和形态分析能试剂条鉴定条件和形态分析能力。力。 逐步