生化分离工程复习提纲

1、第一章 生化分离的研究历史1.生化分离工程:通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得生物化工产品,从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程即称为生化分离工程或称下游加工过程。2.上游:菌种,基因工程,分子生物学,遗传学3.中游:微生物发酵工程,动植物细胞培养, 海洋生物培养4.下游:生物分离工程第二章 发酵液预处理 1.生物分离过程的一般流程2.生物分离工艺要求:(1高纯度;(2大规模;(3经济性;(4生物相容性。3.对产物的要求:(1保持生物产物的活性;纯度要求高;(2当生物技术产品是食品或药物时,要求无污染物、无对映体、无病毒、无热原无致敏原;(3从发酵液和细胞

2、培养液中提取所需生化物质的第一步,分两部分:预处理和固液分离。4.发酵液的成分:包含菌(细胞体,胞内产物,胞外产物及剩余的培养基残分等。对于胞外产物,可先将菌体或其他悬浮杂质去除,才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞内产物,首先富集菌体,再进行细胞破碎和碎片分离,然后提取胞内产物。5.发酵液预处理的原因:(1液相粘度大,大多为非牛顿型流体,不易过滤,所需物质多在液相;(2发酵产物浓度较低,大多为1-10%;(3发酵液成分复杂,不利于提取产物。5.预处理的目的:促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率(1改变发酵液的物理性质,包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸,降低液体黏度;(2相对纯化

3、,去除发酵液中的部分杂质(高价无机离子和杂蛋白质,以利于后续各步操作。(3尽可能使产物转移进入便于后处理的一相中(多数是液相。6.发酵液杂质的去除:(不同杂质的去除方法:发酵液成分复杂,目标产物与各种杂质溶解在一起。这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。(1无机离子的去除:钙离子,在发酵液中加入草酸,可出去钙离子。镁离子,由于发酵液中镁离子含量通常不高,利用草酸很难完全出去镁离子。此时,可加入三聚磷酸钠,三聚磷酸钠与镁离子形成可溶性络合物,即可除去镁离子。铁离子,发酵液中的铁离子,一般用黄血岩去除,使其形成普鲁士蓝沉淀。(2可溶性蛋白质的去除:盐析法;等点沉淀法;有机溶剂沉淀法;其

4、他沉淀法;加热法;吸附法A.盐析法:常用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等,其中应用最多的硫酸铵。 影响盐析的因素有:a.温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在较高的温度(25比0时溶解度低,更容易盐析;b.pH 值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低;c.蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象。因此在盐 析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。B.沉淀法:原料液细胞分离(离心,过滤细胞-胞内产物

5、碎片分离盐析、萃取、超过滤等层析、电泳凝胶过滤、超过滤超过滤结晶、干燥加盐酸胍、脲原料液细胞分离(离心,过滤细胞-胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B 清液-胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等纯化(层析、电泳脱盐(凝胶过滤、超过滤浓缩(超过滤精制(结晶、干燥包含体溶解(加盐酸胍、脲复性a.等电点沉淀法:蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.05.5,调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。b.酸碱调节,使蛋白质与离子形成沉淀:在酸性溶液中,蛋白质与一些阴离子形成沉淀,如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等;在碱性溶液中,蛋白质与一些阳离子形成沉淀,如Ag+、Cu

6、2+、Zn2+、Fe3+等。C.变性法:蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。变性方法:a.加热;b.大幅度调节pH值;c.加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处:加热法只适合于对热较稳定的目的产物;极端pH值也会导致某些目的产物失活,且要消耗大量酸碱;有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。7.有色物质的去除:通常脱色方法为吸附法,如活性炭吸附和树脂吸附。8.发酵液性能的改善:(1降低发酵液的粘度:加热(温度和时间和稀释。(麦芽汁40-75 ,粘度下降50%(2调解pH:蛋白、氨基酸等电点沉淀;减少膜的堵塞;利于细胞、细胞碎片和胶体的絮凝。

7、9.凝聚和絮凝技术:凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。(1凝聚是指在中性盐的作用下,由于双电层排斥电位的降低,而使胶体体系不稳定的现象。作用机理:(1中和粒子表面电荷;(2消除双电层结构;(3破坏水化膜。(2絮凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下,基于桥架作用,使胶粒形成粗大的絮凝团的过程,是一种以物理的集合为主的过程。作用机理:架桥作用。10.工业絮凝剂:(1人工合成有机高分子聚合物;(2天然有机高分子聚合物;(3无机高分子聚合物。11.微生物絮凝剂:包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素

8、及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比,最大的优点是安全,无毒和不污染环境。12.影响絮凝的因素:(1发酵液的性质(细胞浓度,表面电荷;(2絮凝剂的浓度,最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖;(3絮凝剂的分子量;(4pH 控制;(5搅拌速度:初期搅拌要迅速一些,后期搅拌要慢。13.絮凝技术的应用:(1去除细胞体、碎片、蛋白;(2连续发酵中回收酵母;(3生物产品分离。第三章固液分离技术1.常见的固液分离方法:过滤、离心、膜分离、双水相萃取(ATPS、扩张床吸附(EBA2.发酵液分离:发酵液的分离非常困难,最常用的固液分离方法是过滤和离心。体积较大的颗粒:过滤;体积

9、较小的颗粒(1-10m:离心;体积再小:发酵液预处理后再过滤或离心。3.过滤介质:过滤采用的多孔物质;滤浆:所处理的悬浮液;滤液:通过多孔通道的液体;滤饼或滤渣:被截留的固体物质。4.影响过滤的因素(1推动力(悬浮液自身压强差、重力;悬浮液的外加压力;过滤介质的抽真空;(2悬浮液的性质(发酵液的黏度;(3过滤阻力(大多情况下,过滤阻力主要取决于滤饼阻力;(4影响发酵液固液分离的其它因素a.发酵液中悬浮离子的大小;b.菌体的种类和浓度(重要因素,通常丝状菌、动物或植物细胞悬浮液粘度较大,浓度增大,粘度也提高;c.培养液中蛋白质、核酸大量存在:通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大;d.培养基成分:如用

10、黄豆粉、花生粉作氮源,淀粉作碳源,粘度都会升高;e.某些染菌发酵液,如染细菌,则粘度会增大;f.发酵过程的不正常处理,如大量过剩的培养基和消沫油加入,都会使粘度增大。5.过滤速度的强化(1降低滤饼比阻力:一切能够降低滤饼比阻力的方法:如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等;(2降低滤液黏度:黏度愈低,过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调PH、选择合适的放罐时间;(3降低悬浮液中悬浮固体的浓度:过滤速度与获得滤饼体积成反比,因此应尽可能降低培养基配料浓度;(4对发酵液进行预处理,改善滤液性质。6.错流过滤(切向流过滤:传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质,过滤阻力主要来自滤饼。错流过滤打破了传统过滤

11、的机制,即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下,悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动,利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼移走,而附着在滤膜上的滤饼很薄,因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。7.离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。优点:分离速度快;分离效率高;液相澄清度好。8.离心机的种类与用途常速离心机:8000r/min,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离;高速(冷冻离心机:1-2.5×104r/min,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离;超速离心机:转速2.5-8×104r/min,用于D

12、NA、RNA、蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度、沉降系数和相对分子量测定等。第四章细胞破碎和分离提取技术1.不同类型的细胞分泌目标产物的类型:对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎动物细胞:多分泌到细胞外培养液;植物细胞:多为胞内产物;微生物:(细菌/酵母/真菌胞内、胞外产物。2.细胞破碎:技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。3.细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁,破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。4.细胞破碎技术:A.机械破碎法:高压匀浆破碎法,高速珠研磨破碎法,超声波破碎法。机械破碎:通过机械运动产生的剪切力,使组织

13、、细胞破碎(捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法。高压匀浆法适用的范围:酵母和大多数细菌细胞的破碎;料液细胞浓度可以很高,20%左右。不宜使用高压匀浆法:易造成堵塞的团状或丝状真菌;较小的革兰氏阳性菌;含有包涵体的基因工程菌(因包含体坚硬,易损伤匀浆阀。B.非机械破碎法:物理破碎:通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破坏,而使细胞破碎(温度差破碎法、压力差破碎法、渗透压冲击法、冻结和融化法、干燥法。化学破碎:通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎(有机溶剂、表面活性剂、酸碱、EDTA螯合剂。酶促破碎:通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎(自

14、溶法、外加酶制剂法。第五章生物产品萃取技术1.萃取:溶质从料液转移到萃取剂的过程。当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时,生化物质倾向于在两相之间进行分配,当条件选择得恰当时,所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移,集中到一相中,而原来溶液中所混有的其它杂质(如中间代谢产物、杂蛋白等分配在另一相中,这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。2.反萃取:溶质从萃取剂转移到反萃剂的过程。在完成萃取操作后,为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施,将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取。3.双水相现象:是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相

15、容性,当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不互溶的两相。因使用的溶剂是水,因此称为双水相。常用的双水相体系:PEG/葡聚糖体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/葡聚糖体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等;PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶,这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高,葡聚糖价格昂贵的缘故。双水相萃取的基本特点:体系有生物亲和性;非常适合大规模应用;操作容易进行控制;可与细胞破碎相结合;能进行萃取性的生物转化;可进行亲和萃取。双水相萃取的优点:操作条件温和,在常温常压下进行;两相的界面张力小,两相易分散;两相的相比随操作条件而变化;易于连续操作,处理量大,适合工

16、业应用。双水相萃取的工艺流程:目的产物的萃取:使目标蛋白质分配到上相( PEG相 ,而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相;PEG的循环:加入盐使蛋白质转入富盐相回收PEG;将PEG 通过离子交换树脂,先洗出PEG,再洗出蛋白质;无机盐的循环:将含磷酸钠的盐相冷却到6 ,使盐结晶析出,然后用离心机分离收集;用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG 相的盐。双水相萃取技术与层析技术间的相互关系:工业上一般先用超滤等方法浓缩发酵液,再用双水相萃取酶和蛋白质,这样能提高对生物活性物质的萃取效率。最后用层析等技术进一步提纯以得到产品。所以,双水相萃取技术是对层析等高度专一性提纯方法的补充,

17、而不是代替。4.反胶团萃取的分离原理:表面活性剂在非极性的有机相中超过临界胶团浓度而聚集形成反胶团,在有机相内形成分散的亲水微环境。在反胶团中有一个极性核心。5.超临界流体(SCF:纯净物质要根据温度和压力的不同,呈现出液体、气体、固体等状态变化。在温度高于某一数值时,任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相,此时的温度即被称之为临界温度Tc;而在临界温度下,气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。在临界点附近,会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象。当物质所处的温度高于临界温度,压力大于临界压力时,该物质处于超临界状态,温度及压力均处于临界点以

18、上的液体叫超临界流体。超临界流体的特性:超临界流体兼有液体和气体的双重特性,扩散系数大,粘度小,渗透性好,与液体溶剂相比,可以更快地完成传质,达到平衡,促进高效分离过程的实现。超临界状态下的流体对溶质的溶解度大大地增加了,一般可达几个数量级,而在某些条件下甚至可达到按蒸气压计算的1010倍;超临界流体的密度与液体很接近,而它又具有气体扩散性能;在超临界状态下气体和液体两相的界面消失,表面张力为零,反应速度最快,热容量、热传导率等出现峰值;在临界点附近,压力和温度的微小变化可对溶剂的密度、扩散系数、表面张力、黏度、溶解度、介电常数等带来明显的变化;超临界流体的这些特殊性质,使其成为良好的分离介质

19、和反应介质,根据这些特性发展起来的超临界流体技术在分离、提取、反应、材料等领域得到了越来越广泛的开拓利用。超临界流体萃取(SFE:是将超临界流体作为萃取溶剂的一种萃取技术,它兼有传统的蒸馏和液液萃取的特征,是适用面很广的一门新型分离技术。CO2作为萃取最理想的超临界流体优点:超临界二氧化碳的萃取能力取决于流体的密度,可以容易地改变操作条件(压力和温度而改变它的溶解度并实现选择性提取,渗透力强,提取时间大大低于使用普通有机溶剂;二氧化碳无味、无臭、无毒、化学惰性,不污染环境和产品;操做温度接近室温,特别适合遇热分解的热敏性物料;二氧化碳廉价易得,不易燃易爆,使用安全;溶剂回收简单方便,节省能源;

20、超临界二氧化碳萃取集萃取、分离于一体,大大缩短了工艺流程,操作简便;检测、分离方便,能与现代分析手段结合起来,能高效快速地进行药物、化学或环境分析。超临界二氧化碳的局限:对油溶性成分溶解能力较强而对水溶性成分溶解能力较低;设备造价较高而导致产品成本中的设备折旧费比例过大;更换产品时清洗设备较困难。6.超声萃取技术:当超声波在介质中传播时,由于超声波与介质的相互作用,使介质发生物理的和化学的变化,从而产生超声波一系列力学的、热学的、电磁学的和化学的超声效应。(4种效应:机械效应;空化作用;热效应;化学效应微波的基本性质通常呈现为穿透、反射、吸收三个特性。微波萃取的机理:微波辐射过程是高频电磁波穿

21、透萃取介质到达物料内部的微管束和腺胞系统的过程;微波所产生的电磁场可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率;由于微波的频率与分子转动的频率相关连,因此微波能是一种由离子迁移和偶极子转动而引起分子运动的非离子化辐射能。第六章沉淀和膜分离技术1.膜:指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相,把流体相分隔为互不相通的两部分,使这两部分之间产生传质作用。可以是固态、液态或气态的。2.膜分离技术:用天然或人工制备的、具有选择性透过的膜,以外界能量或化学位差为推动力,对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和浓缩的方法。(推动力:压力差、浓度、电位差3.膜分离的特点:操作在

22、常温下进行;是物理过程,不需加入化学试剂;不发生相变化(因而能耗较低;在很多情况下选择性较高;浓缩和纯化可在一个步骤内完成;设备易放大,可以分批或连续操作。4.膜材料的特性:耐压;耐高温;耐酸碱;化学相容性;生物相容性;成本低。5.膜材料:天然材料:各种纤维素衍生物人造材料:有机高分子材料(纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类:是最典型的反渗透膜材料,不耐氯、无机材料6.膜的制备:烧结法、溶剂浇铸法、熔压法、径迹蚀刻法、拉伸法、相转化法等。7.膜的性能主要包括两个方面:透过性能;分离性能。透过性能:透过速率:单位时间、单位膜面积透过组分的通过量,对于水溶液体系,又称透水率或水通量,以J 表示。 tA

23、V J = J :透过速率,m 3/(m 2·h或 kg/(m 2·h;V :透过组分的体积或质量,m 3或kg ;A :膜有效面积,m 2; 水通量:纯水在一定压力、温度(0.35MPa ,25下透过膜的速度,L / h ·m 2。同类膜,孔径越大,水通量越大。 分离性能:截留率:对于反渗透过程,通常用截留率表示其分离性能。截留率反映膜对溶质的截留程度,以R 表示。 c F :原料中溶质的浓度,kg/m 3;c P :渗透物液中溶质的浓度,kg/m 3。 100%截留率表示溶质全部被膜截留;0%截留率则表示全部溶质透过膜,无分离作用。浓差极化:当水透过膜并截留盐

24、时,在膜表面会形成一个流速非常低的边界层,边界层中的盐浓度比进水本体溶液盐浓度高,这种盐浓度在膜面增加的现象叫做浓差极化。浓差极化的危害:分离效果降低,截留率改变,通量下降。克服浓差极化的方法:错流过滤;提高进料流速,增加湍流;提高温度。截留分子量:截留率为 90%时所对应的最小分子量。截留分子量的高低,在一定程度上反映了膜孔径的大小。 分离因数:对于气体分离过程,通常用分离因数表示各组分透过的选择性。8.膜的分类:按孔径大小:微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜;按膜结构:对称性膜、不对称膜、复合膜;按材料分:合成有机聚合物膜、无机材料膜;多孔膜与致密膜:前者微滤膜、超滤膜、纳滤膜,后者反渗透膜

25、、渗透蒸发膜;9.膜分离方法:透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、渗透气化 透析应用:常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、还原剂之类的小分子杂质。 微滤应用:主要从气相和液相物质中截留微米及亚微米级的细小悬浮物、微生物、微粒、污染物等,以达到净化、分离和浓缩的目的。( 除去水、溶液中的细菌和其它微粒; 除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体; 除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质 超滤应用:a.蛋白、酶、DNA 的浓缩;b.脱盐/蛋白质纯化;c.中药生产中滤除分子量大的杂质。 纳滤应用:a.小分子量有机物质的分离;b.小分子无机物的分离;c.溶液中

26、一价盐类与二价或多价盐类的分离。 反渗透应用:a.海水和苦咸水脱盐制饮用水;b.制备医药、化学工业中所需的超纯水;c.用于处理重金属废水。 电渗析应用:a.工业上多用于海水、苦咸水淡化、废水处理;b.生物分离中可用于氨基酸、血清等生物制品的纯化。10.膜使用中最大的问题是膜污染:膜污染的表现:膜通量下降;膜对生物分子的截留性能改变;膜的污染可分为:沉淀污染、吸附污染、生物污染;防止膜污染的方法:原料液的预处理;膜表面的改性;外加场;高压反冲;强化传质;膜污染的清洗方法:化学法(酸、碱、表面活性剂、消毒剂、酶、有机溶剂;物理法(反冲洗、循环清洗;11.常见的膜过滤装置:管式;中空纤维式;平板式;

27、卷式(螺旋式。第七章 色谱原理1.色谱分离技术:一类分离方法的总称,又称色谱法、层析法、层离法等。它是利用不同组分在固定相和流动相中的物理化学性质的差别,使各组分在两相中以不同的速率移动而进一步分离的技术。色谱分离技术目的:用于样品的分离、分析(定性分析或定量分析。2.固定相:在色谱法中,表面积较大的固体或附着在固体上且不运动的液体,静止不动的一相称为固定相。3.流动相:在色谱法中,自上而下运动的一相(一般是气体或液体称为流动相。4.色谱法的分类: 根据进样量分为:色谱分析规模(小于10mg、半制备(10-50mg、制备规模(0.1-10g、工业生产规模(>10g; 根据流动相分为:气相

28、色谱(流动相:气体、液相色谱(液体、超临界流体色谱(超临界液体; 根据固定相的附着方式分为:柱色谱、纸色谱、薄层色谱; 根据分离机理分为:吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱; 根据操作压力分为:低压色谱<0.5MPa ;中压色谱0.54.0MPa ;高压色谱4.040MPa 。5.色谱法的特点:分离效果高;应用范围广;选择性强;设备简单。6.色谱法的缺点:处理量小;操作周期长;不能连续操作。 %100-=F P F c c c R10.吸附色谱法(AC：靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附色谱的固定相为固体吸附剂，如 有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非

29、极性炭及特殊作用的分子筛等。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢 键或化学键。（吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂） AC 分离操作：色谱柱的选择；装柱：a.干法装柱；b.湿法装柱；(3上样：a.湿法上样；b.干法上样；洗脱。 影响参数： 平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数） K= 影响 K 的因素：被分离物质本身的性质、固定相和流动相的性质、色谱柱的操作温度。 阻滞因数（比移值）： a.0Rf1：Rf 越大，溶质随流动相移动快，被洗脱速率也就越快； 斑点到原点的距离 Rf 值 = b.当 Rf=1：此种溶质不溶于固定相，随流动相以同样的速率移动； 溶剂前沿到原点的距离 c.当 Rf=0

30、：此种溶质不溶于流动相，而被吸附在固定相上。 11.吸附剂与展开剂：（薄层吸附色谱分离操作：薄层色谱板的制备、点样、展开、显色） 吸附剂：薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰胺。吸附剂还必须具有一定的活度，活度太高或过低 都不能使混合物各组分得到有效的分离。 展开剂：在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。 展开剂选择的基本原则：对被分离组分有一定的解吸能力，但不能太大；应对被分离的物质有一定的溶解度。 常用溶剂极性次序为： 己烷<环己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇

31、<乙醇<甲醇<水<冰醋酸 12.影响吸附分离的因素：功能基极性；小分子的化合物比大分子的化合物极性大；某些细微结构。 13.吸附色谱法应用：具有不同官能团或相同官能团不同数目的极性化合物及异构体等生物小分子物质的分离分析。 14.高效液相色谱仪（HPLC）：是利用物质在两相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 设备系统：液体输送系统、梯度洗脱装置、进样系统、馏分收集器、检测系统、色谱分离系统。 HPLC 固定相的特性：（与 LC 主要区别与固定相） 较细的颗粒：一般为 510m； 粒度均匀一致； 机械强度好，具有良好的耐高压刚性；如果为多孔性颗 粒，则孔径分布要均匀

32、；化学和热稳定性好，耐酸碱，不容易产生不可逆吸附。 固定相颗粒材料：无机类：硅胶；有机类：有机高分子合成材料，最为常见的是交联聚苯乙烯。 15.正相色谱：流动相极性小于固定相的分配色谱法称为正相色谱法。采用极性固定相（如硅胶），烷烃为流动相的 色谱法是正相液-液分配色谱的代表。正相色谱法主要靠组分的极性差别分离，适用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱：流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相色谱法。在进行反相洗脱时，样品中极性大的组分先 出柱，极性小的组分后出柱，主要分离对象是极性小的物质。 选择流动相时注意事项： 尽量使用高纯度试剂作流动相， 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器

33、噪声增加； 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子；试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积；流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 16.紫外检测器：应用最广，对大部分有机化合物有响应；灵敏度高；线形范围高；波长可选，易于操作；对流动相 的流速和温度变化不敏感； 示差折光检测器：除紫外检测器之外应用最多的检测器；灵敏度低（10-7g/ml） ；对温度敏感；不能用于梯度洗脱 荧光检测器：高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11 g/ml、高选择性； 18.色谱基础知识 色谱流出曲线：由检测器输出的信号强度对时间作图，所得

34、曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。峰高（h）：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。 19.保留值： （1）时间表示保留值 死时间(tM ：不与固定相作用的组分(如空气的保留时间； 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱 长 L 与 tM 的比值计算，即 = L/tM 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间，保留时间是色谱法定性的基本依据； 调整保留时间（tR）：某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间。tR= tR-tM 保留时间是色谱法定

35、性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此有时用保留体积来表示 保留值。 CS CM CS：固定相中的浓度；CM：流动相中的浓度；K 差异越大，色谱分离效果越理想。 （2）体积表示保留值 死体积（VM）：指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检 测器的空间的总和。VM = tM×F0，F0：柱出口处的载气流量，单位 mL/min。 保留体积（VR）：指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。VR =tR×F0。 调整保留体积(VR：某组分的保留体积扣除死体积的值。V R= VR-VM （

36、3）相对保留值 r21：组分 2 与组分 1 调整保留值之比：r21 = t´R2 /t´R1= V´R2/V´R1【相对保留值只与柱温和固定相 性质有关，与其他色谱操作条件（柱径、柱长、填充情况、流动相流速）无关，它表示固定相对这两种组分的选择 性】 20.区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。 衡量色谱峰宽度的参数，三种表示方法： 标准偏差(s：即 0.607 倍峰高处色谱峰宽度的一半；半峰宽(Y1/2：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 s ； 峰底宽(Wb：Wb=4 s 。 2

37、1.从色谱流出曲线获取的信息：根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组分的最少个数；根据色谱峰的保 留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；色谱峰的保留值及其区域宽度，是 评价色谱柱分离效能的依据；色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。 22.色谱分离过程基本关系式 分配系数（平衡常数 K）：一定的温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs 与 在流动相中的浓度 Cm 之比。 影响 K 值的因素：温度、压力、组分的性质、固定相和流动相的性质。 K 值的大小表明组分与固定相作用力的大小，K 值大，组分与固定相的亲和力大

38、，组分在柱中滞留的时间长，组分 在柱中移动速度与其分配系数成反比。 分配比 k（容量因子、容量比）：一定温度下，组分在两相（固定相/流动相）间分配达到平衡时的物质的量比。 k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。 分离因子 a（选择性因子）：相邻两组分的分配系数或容量因子之比，也可用来衡量两物质的分离程度。 如果两组分的 K 或 k 相等，则 =1，两个组分的色谱峰必将重合分不开。两组分的 K 或 k 相差越大，则分离得越好。 KA < K B 浓 因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。 度 A B 若要使 A、B 组分完全分离，

39、必须满足以下三点： A 第一，两组分的分配系数必须有差异； B 第二，区域扩宽的速率应小于区域分 离的速度； 沿柱移动距离 L 第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。 23.塔板理论： 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程， 将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。 （分配色谱） n = L / H，n：色谱柱的理论塔板数；L：色谱柱长；H：虚拟的塔板间距离。 色谱柱的柱效随理论塔板数 n 的增加而增加，随板高 H 的增大而减少。 塔板理论指出： 理论塔板数 n 大于 50 时，可得到基本对称的峰形曲线（正态分布曲线），气相色谱柱的 n 约为 103 -106； 各组分在两相间的分

40、配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，可获得良好的分离； 理论塔板数与色谱参数之间的关系为： n = 5.54( tR 2 = 16( tR 2 Y1/ 2 Wb 例：已知某组分峰的峰底宽为 40 s，保留时间为 400 s ，计算此色谱柱的理论塔板数。 解：n = 16 ( tR / Y2 = 16 ´ （400 / 40）2 = 1600 块。 色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。 24.在液相色谱中，提高柱效的方法： 减小填料颗粒粒度；减小填料孔穴深度；采用低流速流动相；用粘度低的溶剂作流动相；适当提高柱温。 现代高效

41、液相色谱的柱填料粒径都小于 10m。 25.色谱分离中的四种情况： 柱效较高，K（分配系数）较大，完全分离； K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； K 较大,柱效较低，但分离的不好； K 小，柱效低，分离效果更差。 26.分离度（分辨率，R）：色谱图中相邻两峰分离程度的量度。既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离 效能指标。难分离物质分离受色谱过程中两种因素影响：保留值之差；区域宽度。 R= (t R ( 2 - t R (1 1 (Wb ( 2 + Wb (1 2 = 2(t R ( 2 - t R (1 1.699( Y1 2( 2 + Y1 2(1 R=0.8：两峰的分

42、离程度可达 89%； R=1：分离程度 98%； R=1.5：达 99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。 分离度的最佳化，不同分析目的对分离度的要求：定性分析时，需要准确测量 tR 值，最低要求 R0.8；用峰高法进 行定量分析时，要求 R1.0；用测量峰面积法进行定量分析时，要求 R ³ 1.25。 27.色谱法定性分析：纯物质对照定性；相对保留值法；加入已知物增加峰高法；保留指数定性法；与其 他分析仪器联用的定性方法。 28.色谱法定量分析：（依据：当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比） 常用方法：归一化法；外标法（标准曲线法）；内标法。 第八章

43、 常见的生化分离色谱技术 1.凝胶色谱：以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各组分的分子大小不同而达到物质分离 目的的一种色谱技术。 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 GFC 一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。 GPC 主要用于分离测定有机溶剂中可溶的高聚物的分子量和分子量分布，常用的凝胶为聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为 四氢呋喃等有机溶剂。 2.凝胶色谱理论 VtVo 十 Vi 十 Vg；Vt：柱床总体积；Vi =g（干凝胶质量）×Wr（凝胶单位

44、吸水量）； Vo：柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积；Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积；Vg：干凝胶颗粒体积。 Vo 的测定：选分子量约 200 万的蓝色葡聚糖 2000，测定其洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的 Vo 值。 Vi 的测定：选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积 Vei，减去 Vo 就是该柱的 Vi。 常用铬酸钾(黄色或有 UV 吸收的物质如 N-乙酰酪氨酸乙酯来测定 Vi。 D 2 Vt 的测定： D 为柱直径，h 为凝胶床的高度。 Vt = p（ ） ×h 2 3.凝胶特性参数 排阻极限：不能进入到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量；

45、 渗入极限：能够完全进入到凝胶网络内部的最大分子的相对分子量； 分级范围：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质； 溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，的相对分子质量范围； 凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。 4.类分离（组分离）：将分子量极为悬殊的两类物质分开。 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。 5.分级分离：将分子量相差不大的大分子物质加以分离。 使各种物质的 Kd 值尽可能相

46、差大；不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧；如果样品中含有 3 个组分的话， 最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的 3 倍，并小于排阻限的 1/3。 6.凝胶色谱的应用：分离纯化；脱盐；相对分子量的测定；浓缩。 7.离子交换色谱法(IEC：是利用离子交换树脂为固定相，以适宜的溶剂作为移动相，使溶质按它们的离子交换亲和 力的不同而得到分离的方法。 基本原理：带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离的技术。蛋白质等两性电解质，当 pH < pI 时，蛋白质带净正电荷；当 pH > pI 时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大

47、分子的等电点不同，可 以通过改变溶液的 pH 和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。 基本过程：初始稳定状态；离子交换过程；洗脱过程；介质的再生过程。 8.离子交换树脂的结构：不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；与 骨架相联的功能基团；与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进出，发生离 子交换现象。 阳离子交换树脂：活性离子为阳离子的交换树脂。阳离子交换树脂的活性基团为酸性，对阳离子具有交换能力。 按活性基团分类可分为强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂具有强酸性基 团， 其电离程度不随外界溶液的 pH 而变化， 所以使用时的 pH 一般没有限制； 弱酸性阳离子交换树脂的电离程度小， 其交换性能和溶液的 pH 有很大关系。在酸性溶液中，这类树脂几乎不能发生交换反应，交换能力随溶液的