chapter+19+两水相萃取

1、19 两水相萃取法(aqueous two-phase system,ATPS)双水相分配法掌握：聚合物的不相溶性、相图含义（双掌握：聚合物的不相溶性、相图含义（双节线、系线、临界点）。节线、系线、临界点）。了解：分配理论（表面能影响和电荷影了解：分配理论（表面能影响和电荷影响）、影响分配的参数响）、影响分配的参数与有机溶剂萃取比较含水量高（含水量高（7090%），是接近生理环境下操），是接近生理环境下操作。作。分相时间短（特别是聚合物分相时间短（特别是聚合物/盐系统）。自然分盐系统）。自然分相时间一般为相时间一般为515min。界面张力小，有助于强化相际间的质量传递界面张力小，有助于强化相际

2、间的质量传递不存在有机溶剂残留问题不存在有机溶剂残留问题大量杂质能与所有固体物质一同除去。大量杂质能与所有固体物质一同除去。设备投资少，操作简单，易于放大和连续操作设备投资少，操作简单，易于放大和连续操作大多数目标产物有较高的收率，分配系数一般大多数目标产物有较高的收率，分配系数一般为为3.双水相萃取发展简史双水相萃取发展简史1896年荷兰微生物学家年荷兰微生物学家Beijerinck发现，当明发现，当明胶与琼脂或与可溶性淀粉混合，得一个混浊不胶与琼脂或与可溶性淀粉混合，得一个混浊不透明液，随之分成透明液，随之分成2相，上相大部分是水，下相相，上相大部分是水，下相含大部分琼脂或淀粉，含大部分琼

3、脂或淀粉，2相主要成分都是水，称相主要成分都是水，称为为“聚合物的不相溶性聚合物的不相溶性”。1956年，瑞典（年，瑞典（Lund）大学的）大学的Albertsson等等再次发现，并用盐代替高聚物葡聚糖时，也能再次发现，并用盐代替高聚物葡聚糖时，也能形成二相，随后系统研究生物、细胞与蛋白质形成二相，随后系统研究生物、细胞与蛋白质在在2相中的分配，形成双水相萃取技术。相中的分配，形成双水相萃取技术。20世纪世纪6070年代，双水相技术主要集年代，双水相技术主要集中在细胞生物学领域。中在细胞生物学领域。1979年，年，kula 等开创用双水相技术分离等开创用双水相技术分离蛋白质的先河。蛋白质的先河

4、。目前，双水相技术用于目前，双水相技术用于酶的分离提取酶的分离提取 胞内酶的提取或精制上胞内酶的提取或精制上细胞、细胞器、膜等粒子的分离提取细胞、细胞器、膜等粒子的分离提取生物活性物质的分析检测生物活性物质的分析检测分离纯化的应用分离纯化的应用两水相体系发展中的问题两水相体系发展中的问题 相体系回收相体系回收(1) (1) 环境环境(2) (2) 成本成本双水相的形成双水相系统双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)Kpi = 磷酸钾DX = 葡聚糖(dextran)1、Pro如何分布2、影响因素

5、3、应用2.2%葡聚糖水溶液葡聚糖水溶液+等体积的等体积的0.72%甲基纤维素钠溶液甲基纤维素钠溶液0.39%葡聚糖0.65%甲基纤维素钠98.9%水1.58%葡聚糖0.15%甲基纤维素钠98.27%水EO环氧乙烷环氧乙烷PO-环氧丙烯环氧丙烯典型的两水相系统典型的两水相系统PPG非离子型（P）/非离子型聚合物（Q）PEGPVAPVP两种聚合物分子间如存在强的吸引力，则两种聚合物分子间如存在强的吸引力，则它们结合后存在于一相中；如两种聚合物它们结合后存在于一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子希望在它周围的分间有斥力，即某种分子希望在它周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡子是同种分子

6、而不是异种分子，达到平衡后会形成两相，两种聚合物分处一相，称后会形成两相，两种聚合物分处一相，称为为聚合物的不相溶性聚合物的不相溶性。加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。溶液也能形成两相。19.219.2 相图相图由两种聚合物和水组成的系数由两种聚合物和水组成的系数。名词解释：双节线，系线，临界点。名词解释：双节线，系线，临界点。MTBMVVRBT系线系线上相：二相区上相：二相区下相：均匀区下相：均匀区K：临界点：临界点TTKBB曲线：双节线曲线：双节线M：某个系统组成：某个系统组成说明：说明： 以双节线下面的区域是均匀区。在双节线上面的区

7、域是两相区。 在同一条系数上的各点分成的两相，具有相同的组成，但体积比不同。 当系数向下移动时，长度逐渐减少，这说明两相的差别减少。 双节线的位置及形状与聚合物的分子量，聚合物的种类及温度有关。 聚合物的分子量越高，形成两相分离所需的浓度越低，两种聚合物的分子量相差越大，双节线的形状越不对称。而时间的长短与许多因素有关。相图测定 实验法测定：将一定量的高聚物实验法测定：将一定量的高聚物P浓溶液置浓溶液置于试管内，然后用已知浓度的高聚物溶液于试管内，然后用已知浓度的高聚物溶液Q来滴定。随着高聚物来滴定。随着高聚物Q的加入，试管内溶液的加入，试管内溶液由均相突然变混浊，纪录由均相突然变混浊，纪录Q

8、的加量。然后再的加量。然后再在试管内加入在试管内加入1ml水，溶液又变轻，继续滴水，溶液又变轻，继续滴加高聚物加高聚物Q，溶液又变混浊，计算此时系统，溶液又变混浊，计算此时系统的总组成。以此类推，由实验测定一系列的总组成。以此类推，由实验测定一系列双节线上的系统组成点，以高聚物双节线上的系统组成点，以高聚物P浓度对浓度对Q浓度作图，即可得双节线。浓度作图，即可得双节线。分配理论分配理论尽量理解尽量理解表面能的影响kTMeKK-分配系数M分子量表面能分配系数分配系数K电荷的影响1019,88)(lnln12*公式PUURTZFKKiiZAZBKKFZZRTUUln)(12如果如果KB/KA不等，

9、那么就有电位差不等，那么就有电位差19193)、静电作用、静电作用非电解质型溶质非电解质型溶质:电中性蛋白质电中性蛋白质的的m0： 式中式中, M: 溶质分子量溶质分子量; : 溶质在溶质在上下两相表面自由能的差上下两相表面自由能的差, J/mol。意义：意义：A不受静电作用的影响不受静电作用的影响(因不因不带电带电);B 一般一般 0，不同溶质，不同溶质lnm随随M 而而 ；CATPS不同不同, 同一溶质的同一溶质的也就不同，也就不同，m随随ATPS不同而改变。不同而改变。图是不同图是不同pro在在pH为各为各pro的的pI的的ATPS中的中的m, 道南电位道南电位(, Donnan pot

10、ential)实际实际ATPS中有电解质中有电解质, 当这些离子在两当这些离子在两相中相中m 1), 将两相间产生电位差将两相间产生电位差 带电带电pro的的m:意义：意义：A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比净电荷数成正比.B 由于同一由于同一ATPS中添加不同的盐产生中添加不同的盐产生的的不同不同,故故m与与Zpro的关系因盐而的关系因盐而异。异。19.4 19.4 影响分配的因素影响分配的因素19.4.1 19.4.1 聚合物的分子量聚合物的分子量 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配富含该聚合物的相。此规律

11、不论何种成相聚配富含该聚合物的相。此规律不论何种成相聚合物系统进行分配的生物高分子都适用。合物系统进行分配的生物高分子都适用。如：如：PEGPEGDXDX系统中，系统中，PEGPEG的分子量的分子量KK （K=CK=C上上/ /C C下下）；）； DXDX的分子量的分子量KK19.4.219.4.2聚合物的浓度聚合物的浓度当接近临界点时，蛋白质均匀地分配两相，当接近临界点时，蛋白质均匀地分配两相，K K接近接近1 1。成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，系统远临界点，系线的长度也浓度增加时，系统远临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也

12、增大，增加，此时两相性质的差别也增大，K1K1K1。19.4.319.4.3盐类的影响盐类的影响，由于各水相应保持，由于各水相应保持电中性，因而在两水相形成电位差，这时带电电中性，因而在两水相形成电位差，这时带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。很大的影响。RTFZkk0lnln1 1、 盐的种类盐的种类 7.4.3.27.4.3.2盐的浓度盐的浓度 当当pH6.9pH6.9时，在时，在PGE4000 8%PGE4000 8%及及DX500DX500的两相系统的两相系统加入加入NaClNaCl时，对蛋白质的分配产生很大的影响。时，对蛋白

13、质的分配产生很大的影响。结论：结论：l 加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。种蛋白质的分离。l 当盐的浓度继续增加时，影响逐渐减弱，分配当盐的浓度继续增加时，影响逐渐减弱，分配系数基本上无变化。系数基本上无变化。19.4.4 19.4.4 pHpH值值pHpH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。而改变蛋白质所带电荷和分配系数。 RTFZkk0lnlnpHpH也影响磷酸盐的离解程度。也影响磷酸盐的离解程度。 pH pH影响影响H H2 2POPO4 4- -和和HP

14、OHPO4 42-2-之间的比例，使之间的比例，使U U2 2-U-U1 1发生变化，从而影响发生变化，从而影响K K。 讨论：讨论：如何设计利用两水相技术测定两如何设计利用两水相技术测定两性物质的性物质的pIpI？ 在不同的盐系统中，生物大分子在在不同的盐系统中，生物大分子在pH=pIpH=pI处，其处，其K=KK=K0 0相相同。同。19.4.5 19.4.5 温度温度 T T影响相图，特别在临界点附近，尤为显著。影响相图，特别在临界点附近，尤为显著。因而影响因而影响K K。一般常温操作一般常温操作节约冷冻费用。节约冷冻费用。室温下，室温下，较低，容易相分离。较低，容易相分离。成相聚合物对

15、蛋白质有稳定作用。成相聚合物对蛋白质有稳定作用。19.4.6 荷电荷电PEG作为成相聚合物作为成相聚合物 可以增大两相间的电位差。利用荷电可以增大两相间的电位差。利用荷电PEG能能产生较大的相间电位，能使分配系数增加。产生较大的相间电位，能使分配系数增加。全醪液分离技术全醪液分离技术采用双水相技术就可以避免乳化采用双水相技术就可以避免乳化 , ,直接从醪液中提直接从醪液中提取。取。细胞、细胞碎片和培养基中的不溶物对分配行为没细胞、细胞碎片和培养基中的不溶物对分配行为没有显著的影响有显著的影响 , ,所以不同批次的发酵液可以取得几所以不同批次的发酵液可以取得几乎相同的结果。而且细胞和产物分离在两

16、相乎相同的结果。而且细胞和产物分离在两相 , ,避免避免了胞内的降解酶类对产物的破坏作用。了胞内的降解酶类对产物的破坏作用。补充：聚合物和盐的回收利用补充：聚合物和盐的回收利用缺点缺点：由于反复的使用，：由于反复的使用，PEG PEG 相中可能含有大量的蛋白酶相中可能含有大量的蛋白酶和其他杂质，这对目标产物的分离不利。和其他杂质，这对目标产物的分离不利。回收聚合物的方法回收聚合物的方法：超滤法、离心法、清洗法、酶沉淀法：超滤法、离心法、清洗法、酶沉淀法和离子交换吸咐和离子交换吸咐 法等。法等。盐的回收盐的回收：冷却盐相至低温，使得盐结晶析出，然后用离心或过滤冷却盐相至低温，使得盐结晶析出，然后

17、用离心或过滤等方法收集；等方法收集；电渗析的方法回收盐类以及对电渗析的方法回收盐类以及对PEGPEG相除盐。相除盐。19.519.5应用应用双水相系统的选择双水相系统的选择 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。双水相提取胞内酶的具体操作：双水相提取胞内酶的具体操作：两水相萃取的发展两水相萃取的发展1 1、体系的成本较低

18、，但已成功地应用于工业生产，但是体系中盐浓度高，无法实现亲和分配，并会破坏某些生物物质的活性，而使其应用范围受到限制。 DEXDEX较贵，较贵，PEG/DEXPEG/DEX难以工业化生产。难以工业化生产。2 2、合、合成高聚物微粒与亲和凝胶微粒的应用成高聚物微粒与亲和凝胶微粒的应用3 3、4 4、表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体聚集体当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚集体性剂会在水溶液中形成聚集体表面活性剂的极表面活性剂的极 性头朝外，疏水性头朝外，疏水 的尾部朝内，中的尾部朝内，中 间形成非极性的间形成非极性的 “核核”水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”表面活性剂的极性头朝内，疏水表面活性剂的极性头朝内，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 间形成极性的间形成极性的“核核”有机溶剂极性“头”极性的“核”非极性“尾”反微团的优点 （1）极性