生物：12《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版选修3)

1、 1. “分子手术刀分子手术刀”是是_，主要来源于，主要来源于_。经限制酶切割产生的。经限制酶切割产生的DNA片段末端片段末端通常有两种形式：通常有两种形式：_ _和和_ _。 2.“分子缝合针分子缝合针” 是是_， 分为两类：分为两类： 和和 。 3.“分子运输车分子运输车” 是是_ _，种类：，种类：_、 _、 _。 4.载体具备的条件载体具备的条件 能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中_并稳定保存。并稳定保存。 有一个或多个有一个或多个_切割位点，供外源基因插入。切割位点，供外源基因插入。 具有特殊的具有特殊的_，共重组，共重组DNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。 对受体细胞对受体细胞 。 5

2、.GAATTC CTTAAG 被切割后形成的片段是：被切割后形成的片段是： 和和 。餐前小菜餐前小菜原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因

3、结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的

4、、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码餐前小菜味道如何？餐前小菜味道如何？ 思考：思考：启动子与起始密码子，终止子与终启动子与起始密码子，终止子与终止密码子是否相同，如不同有何区别？止密码子是否相同，如不同有何区别？启动子、终止子：在启动子、终止子：在 上，分上，分别表示别表示 的开始与结束的开始与结束起始密码子、终止密码子：起始密码子、终止密码子：在在 上，分别表示上，分别表示 的开的开始与结束始

5、与结束转录转录翻译翻译DNARNA正餐开始。正餐开始。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的基因，也可以编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。是一些具有调控作用的因子。2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术

6、扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1、什么是基因文库？、什么是基因文库？2、什么是基因组文库？、什么是基因组文库？3、什么是部分基因文库？、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本第阅读课本第9页的相关内容，回答以下问题页的相关内容，回答以下问题自主学习自主学习(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因2、什么是基因组文库？、什么是基因组文库？3、什么是部分基因文库？、什么是部分基

7、因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本阅读课本9页的相关内容，回答一下问题页的相关内容，回答一下问题自主学习自主学习 基因文库基因文库：将含有某种生物不同基因的许多：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因物的不同的基因,称为基因文库称为基因文库(gene library)(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因3、什么是部分基因文库？、

8、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本阅读课本9页的相关内容，回答一下问题页的相关内容，回答一下问题自主学习自主学习 基因文库基因文库：将含有某种生物不同基因的许多：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因物的不同的基因,称为基因文库称为基因文库(gene library)基因组文库：基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中

9、包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本阅读课本9页的相关内容，回答一下问题页的相关内容，回答一下问题自主学习自主学习 基因文库基因文库：将含有某种生物不同基因的许多：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因物的不同的基因,称为基因

10、文库称为基因文库(gene library)基因组文库：基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库部分基因组文库：部分基因组文库：基因文库中包含了一种生物的一部分基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.（如如cDNA文库文库）基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系 阅读课本阅读课本P10生物技术资料卡生物技术资料卡 提出你的疑问？提出你的疑问？提取某种生物的提取某种生物的某器官某器官或或特定发育时期特定发育时期的的mRNA

11、mRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA文库的构建文库的构建-反（反（逆）转录法：逆）转录法： 小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 前提：前提：_原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为

12、扩增循循 环的次数）环的次数）聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制指数指数2 2n n要有一段已知目的基因的核苷酸序列要有一段已知目的基因的核苷酸序列自主学习自主学习阅读课本阅读课本P10-P11页的相关内容，回答一下问题页的相关内容，回答一下问题（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程： 过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链

13、）重复循环重复循环进一步思考：在这个过程中进一步思考：在这个过程中都需要什么条件？都需要什么条件？模板模板DNA；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；酶）；能量；能量；DNA引物；引物；具体过程具体过程PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶、原料、引物模板、能量、酶、原料、引物DNADNA在高温下在高温下变性解旋变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复

14、制主要细胞核内主要细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶 细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子（3 3）、人工合成的目的基因）、人工合成的目的基因牛刀小试牛刀小试 同步练习册同步练习册P6 基础巩固基础巩固1 1、3 3从前你要扩增从前你要扩增DNADNA， 总有培养大批细胞的重任要你背。总有培养大批细胞的重任要你背。 这时有个家伙叫这时有个家伙叫KaryKary Mullis Mullis博士的，博士的， 他钻出来说体外合成也一样他钻出来说体外合成也一样OKOK！ 只要把你的模板混上缓冲液，再加些引只要把你的模

15、板混上缓冲液，再加些引物，物， 还有核苷和聚合酶。还有核苷和聚合酶。 变性，退火，和延伸。变性，退火，和延伸。 加热加热 冷却冷却 加热加热 太神奇了！太神奇了！ 当你想要检测突变，来啊做当你想要检测突变，来啊做PCRPCR吧！吧！ 当你想要基因重组，来啊做当你想要基因重组，来啊做PCRPCR吧！吧！ 当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCRPCR吧！吧！ 当你想要侦破大案，来啊做当你想要侦破大案，来啊做PCRPCR吧！吧！二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心问题问题1为何要构建基因表达载体？为何要构建基因表达载体？ 问题问题2作为基因工程表达

16、载体，只需含有目的基因作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？就可以完成任务吗？为什么？问题问题3基因表达载体的构建需要哪些工具酶，如何基因表达载体的构建需要哪些工具酶，如何将目的基因与运载体连接起来形成重组将目的基因与运载体连接起来形成重组DNA分子（以分子（以质粒为运载体）？质粒为运载体）？问题问题4将目的基因与载体混合并用将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？粒？ 小组讨论：小组讨论：a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定

17、存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用问题问题2 2：作为基因工程表达载体，只需含有目的作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？基因就可以完成任务吗？为什么？二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心问题问题1 1：为何要构建基因表达载体？为何要构建基因表达载体？1.1.基因表达载体的作用：基因表达载体的作用：2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA聚合酶结

18、合位点聚合酶结合位点位于基因的尾端位于基因的尾端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞问题问题3 3：基因表达载体的构建需要哪些工具酶？基因表达载体的构建需要哪些工具酶？如何将目的基因与运载体结合起来形成重组如何将目的基因与运载体结合起来形成重组DNADNA分子（以质粒为运载体）？分子（以质粒为运载体）？工具酶：限制酶、工具酶：限制酶、DNADNA连接酶连接酶质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同种同种过程过程: :问题问题4 4：

19、将目的基因与载体混合并用将目的基因与载体混合并用DNADNA连接酶处连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？重组质粒？ 目的基因目的基因-目的基因连接物目的基因连接物 目的基因目的基因-载体连接物载体连接物 载体载体-载体连接物载体连接物 例例1图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P为启动子，为启动子，T为终止子，为终止子，ori

20、为复制原点。已知目为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多在内的多种酶的酶切位点。据图回答：种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切，酶切产物用酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间片段之间连接形成的产物有连接形成的产物有_、_、_ _三种。若要从这些连接产物中分离出重组三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行质粒，需要对这些连接产物进行_。（2）用上述）用上述3种连接产物与无任何

21、抗药性的原核宿主细胞进行转化种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是产物是_ _。（3）目的基因表达时，）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是，其合成的产物是_。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后）在上述实验中

22、，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。 分离纯化分离纯化 载体载体-载体连接物载体连接物 目的基因目的基因-载体连接物、载体载体连接物、载体-载体连接物载体连接物 启动子启动子 mRNA EcoRI和和BamHI 目的基因目的基因-目的基因连接物目的基因连接物 目的基因目的基因-载体连接物载体连接物 载体载体-载体连接物载体连接物 载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础

23、上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细

24、胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法用用CaCa+ +处理细胞处理细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体内，并且在受体细胞内维持细胞内维持 和和 的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞

25、并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法（基因枪法（成本高成本高）（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵移植到子宫或移植到子宫或输卵管输卵管受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物受体细胞是什么？受体细胞是什么？为什么采用受精卵？为什么采用受精

26、卵？体积大，易操作；体积大，易操作；全能性高全能性高3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNACa2+处理：处理：可增大细胞壁的通透性，使重组质粒能够可增大细胞壁的通透性，使重组质粒能够导入到受体细胞导入到受体细胞将目的基因导入受体细胞中的方法的比较将目的基因导入受体

27、细胞中的方法的比较生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法受体细胞受体细胞转化过程转化过程农杆菌转化法农杆菌转化法, ,基基因枪法，花粉管因枪法，花粉管通道法通道法显微注射法显微注射法Ca2Ca2处理法处理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞目的基因插入目的基因插入TiTi质质粒的粒的T-DNAT-DNA上上农农杆菌杆菌导入植物细导入植物细胞胞整合到受体细整合到受体细胞的染色体胞的染色体DNADNA表达表达目的基因表达目的基因表达载体提纯载体提纯取取卵卵( (受精卵受精卵)显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获获得具有新性状得具有新性状的动物的

28、动物Ca2Ca2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重重组表达载体与感组表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学

29、发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗原-抗体抗体杂交杂交2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交过程过程: 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗原-抗体抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定(核心）、目的、组成核心）、目的、组成植物、