第八章 印迹技术

1、第一节核酸分子杂交第二节探针与标记第三节固相支持物与印迹第四节常用核酸印迹杂交技术常用核酸印迹杂交技术第五节影响杂交的因素第六节蛋白质印迹法第七节生物芯片z掌握基本概念（印迹杂交技术 、探针等）核酸分子杂交基本原理，核酸探针应具有的条件，核酸探针的种类，DNA印迹杂交的主要步骤。z熟悉常用印迹杂交技术和芯片技术印迹杂交技术印迹杂交技术 印迹技术印迹技术(blotting)(blotting)是指将样品（核是指将样品（核酸或蛋白质）电泳分离并转移到固相酸或蛋白质）电泳分离并转移到固相载体上，然后在载体上利用特异性的载体上，然后在载体上利用特异性的反应来检测样品的一种方法。反应来检测样品的一种方法

2、。 印迹技术(blotting) Southern blotting用于分析用于分析DNA Northern blotting用于分析用于分析RNA Western blotting用于分析蛋白质用于分析蛋白质 Eastern blotting用于分析蛋白质用于分析蛋白质 (双向电泳蛋白质双向电泳蛋白质印迹技术印迹技术)核酸分子杂交基本原理核酸分子杂交基本原理 复性复性变性变性 核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。补配对原则形成双链的过程。（固相和液相杂交）（固

3、相和液相杂交）探针探针(probe) 杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序列，通常把已知的核酸序列称作探针（列，通常把已知的核酸序列称作探针（probe）。）。 探针探针(probe)(probe)，是指与待测的分子发生特异性相互，是指与待测的分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。作用，并可被特殊的方法探知的分子。 除了核酸探针外，探针利用抗体除了核酸探针外，探针利用抗体- -抗原、生物素抗原、生物素- -抗生物素蛋白、生长因子抗生物素蛋白、生长因子- -受体的相互作用的原理受体的相互作用的原理与靶分子结合。与靶分子结合。 核酸

4、探针应具有的条件：核酸探针应具有的条件： 带有标记物；带有标记物； 单链；单链； 高度特异性；高度特异性； 检测方法应简单，灵敏度；检测方法应简单，灵敏度；核酸探针的种类核酸探针的种类 基因组基因组DNADNA探针探针 cDNAcDNA探针探针 RNARNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 核酸探针标记物核酸探针标记物 分为放射性标记探针和非放射性标记探针两分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类大类 1 1、放射性同位素、放射性同位素应用广泛，以应用广泛，以3232P P应用最普遍，放射自显影。应用最普遍，放射自显影。优点：灵敏度高；优点：灵敏度高；缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。

5、缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。 2 2、非放射性标记物、非放射性标记物生物素：生物素：一种小分子水溶性维生素，一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上，连接在碱基上，和抗生物素蛋白（和抗生物素蛋白（avidinavidin）特异结合，）特异结合，抗生物素蛋白上连接有显色物质抗生物素蛋白上连接有显色物质( (酶、荧光素等酶、荧光素等) ) 。地高辛：地高辛：一种类固醇半抗原分子，一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。原理类似于生物素的检测。 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸酸(dNTP(dN

6、TP) )上，然后可通过切口平移法、随上，然后可通过切口平移法、随机引物法、机引物法、PCRPCR标记法、末端标记法等方法标记法、末端标记法等方法标记探针标记探针 核酸探针的制备核酸探针的制备 切口平移法切口平移法反应成分：反应成分：Dnase I，E coli pol I, dATP,dGTP, dTTP, 32P-dCTP,待标记的待标记的DNA片段片段标记结果：标记结果：两条链都均匀标记两条链都均匀标记。5353双链双链DNA53535353带切口的带切口的双链双链DNADnase IMg2+E coli pol I-32P-dNTP变性变性32P部分标记的部分标记的单链单链DNA片段片

7、段切口原始位置切口原始位置切口最终位置切口最终位置32P标记的标记的DNADNA切口平移标记法切口平移标记法随机寡核苷酸引物（随机寡核苷酸引物（random primer)random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用起到聚合酶反应引物的作用 E.coliE.coli DNA DNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow大片段（仅具大片段（仅具有有5-35-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）多聚酶的活性，而无外切酶的活性）随机引物法随机引

8、物法（randompriming )5353双链双链DNA35 单链单链DNA变性变性随机引物随机引物35Klenow片段片段-32P-dNTP35变性变性32P标记的单链标记的单链DNA探针探针DNA的随机引物标记法的随机引物标记法PCRPCR标记法标记法 在在PCR反应底物中，将一种反应底物中，将一种dNTP换成标记物标换成标记物标记的记的dNTP，这样标记的，这样标记的dNTP就可在就可在PCR反应的反应的同时掺入到新合成的同时掺入到新合成的DNA链上链上。 末端标记法末端标记法 DNA末端末端标记法只是将末端末端标记法只是将DNA片段的一片段的一端（端（5端或端或3端）进行部分标记。由

9、于标记端）进行部分标记。由于标记活性不高，标记物掺入率低，一般极少用活性不高，标记物掺入率低，一般极少用做核酸分子杂交探针标记。做核酸分子杂交探针标记。末端标记法末端标记法探针的纯化探针的纯化 目的：除去游离的标记dNTP 方法：乙醇沉淀、凝胶过滤核酸印迹杂交技术原理和流程核酸印迹杂交技术原理和流程（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片DNA印迹杂交的主要步骤印迹杂交的主要步骤 待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切 待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶

10、电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性 印迹（转膜）：印迹（转膜）： 硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭）预杂交（封闭） 探针的制备探针的制备 固相膜上杂交（控制温度）固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测杂交信号的检测印迹杂交过程 样品制备 电泳分离 印迹 预杂交 杂交 洗膜 分析固相支持物固相支持物 电泳用的凝胶不能直接做支持物 将核酸分子结合于表面 有较好的机械强度 常用硝酸纤维膜和尼龙膜上行毛细

11、管转移上行毛细管转移凝胶凝胶滤纸滤纸玻璃板玻璃板重物（重物（500g）支持物支持物转移缓冲液转移缓冲液滤纸滤纸NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜吸水纸吸水纸（1）毛细管虹吸转移法）毛细管虹吸转移法几种转膜方法：几种转膜方法：（2）电转移）电转移一般用尼龙膜作电转移的载体（一般用尼龙膜作电转移的载体（NCNC膜不行）膜不行）单链单链DNADNA和和RNARNA可进行转移，双链可进行转移，双链DNADNA先在原位进行碱先在原位进行碱变性，随后中和，再转移变性，随后中和，再转移特点：转移快，特点：转移快，2-32-3小时即可；小时即可；（3）真空转移）真空转移使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。使用

12、真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。电转移法真空转移法预杂交 固相膜可结合DNA，包括探针。 封闭固相膜上多余的结合位点。 常用非特异性的DNA或蛋白质。影响杂交的因素影响杂交的因素 杂交温度， 离子强度 DNA和探针浓度 杂交促进剂，聚乙二醇 杂交时间常用核酸杂交分类常用核酸杂交分类Southern印迹印迹 检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA分子分子, 需转印到膜上需转印到膜上 Northern印迹印迹 检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA分子分子, 需转移到膜上需转移到膜上 斑点杂交斑点杂交 检测未经分离的检测未经分离的,固定在膜上的固定在膜上的 DNA或或RN

13、A分子分子 菌落杂交和噬斑杂交菌落杂交和噬斑杂交 检测固定在膜上的检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和经裂解后从细菌和 噬菌体中释放的噬菌体中释放的DNA分子分子原位杂交原位杂交 检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或RNA分子分子 杂交方法杂交方法 适用范围适用范围一、一、DNA印迹法（印迹法（Southern bloting ） 将电泳分离的待测将电泳分离的待测DNA片段转移并结片段转移并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测探针检测待测DNA的一种方法。的一种方法。用途：检测目的用途：检测目的DNA的存在，基因突变的存在，基因突

14、变DNA凝凝胶电泳胶电泳变性变性使使DNA单链转单链转移到硝酸纤维移到硝酸纤维素膜（素膜（NC）毛细管作用毛细管作用电转移电转移真空吸引真空吸引与探针进与探针进行杂交行杂交放射自放射自显影显影显出杂显出杂交区带交区带Southern blottingSouthern印迹杂交法印迹杂交法M1 210SSC 转移缓冲液转移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜放放射射自自显显影

15、影照照片片操作：与操作：与DNA印迹相似印迹相似 RNA经变性后再电泳，经变性后再电泳， 凝胶中加甲醛保持凝胶中加甲醛保持RNA单链。单链。用途：检测用途：检测mRNA、检测基因表达情况、检测基因表达情况二、二、RNA印迹法（印迹法（Northern bloting）RNA凝凝胶电泳胶电泳使使DNA单链转单链转移到硝酸纤维移到硝酸纤维素膜（素膜（NC）毛细管作用毛细管作用电转移电转移真空吸引真空吸引与探针进与探针进行杂交行杂交放射自放射自显影显影显出杂显出杂交区带交区带Northern Blot-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达(三、斑点印迹三、斑点印迹操

16、作：不做电泳分离，将操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品样品变性后点在干的变性后点在干的NC上，与探针杂交。上，与探针杂交。用途：检测用途：检测DNA样品同源性、细胞内特样品同源性、细胞内特 定基因拷贝数；定基因拷贝数；mRNA的相对含的相对含 量。量。四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法操作：操作：NC膜拓印培养的菌落膜拓印培养的菌落原位裂解菌落，释放原位裂解菌落，释放DNA预杂交预杂交杂交杂交结果分析结果分析从原培养皿筛选含目的从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落的阳性菌落用途：筛选含有特异用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落序列的阳性菌落 或噬菌斑或噬菌斑菌菌落

17、落杂杂交交概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并 对其实行检测的方法，称为核酸原位对其实行检测的方法，称为核酸原位 杂交（杂交（nucleic acid hybridization in situ)用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位；用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位； 研究细胞特定基因表达水平；确定组织研究细胞特定基因表达水平；确定组织 有无病原体感染等。有无病原体感染等。五、核酸原位杂交（组织原位杂交）五、核酸原位杂交（组织原位杂交）原位杂交原位杂交蛋白质印迹法蛋白质印迹法 Western Western 印迹法（印迹法（Western blo

18、tingWestern bloting）分析）分析蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法 用途：用途： 鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。 典型的印迹过程包括三个步骤典型的印迹过程包括三个步骤 蛋白质的电泳分离；蛋白质的电泳分离； 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区

19、域；体膜上未吸附蛋白质区域； 免疫学检测。免疫学检测。 免疫印免疫印迹迹（Western blotting)将待测蛋白质将待测蛋白质（抗原）变性（抗原）变性电泳电泳转移到转移到NC膜上膜上加入加入抗体抗体加入标记加入标记的二体的二体显示显示区带区带检测检测封闭封闭检测分析生物芯片技术（生物芯片技术（biochips）传统核酸印迹杂交的缺点： 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等生物芯片（生物芯片（biochips）指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面

20、构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。 生物芯片的特点：生物芯片的特点：高通量高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子） 微型化微型化（可装入口袋） 自动化自动化（技术自动化；结果分析自动化） 低成本低成本（相对于同时进行大量分子研究而言） 生物芯片的分类：生物芯片的分类：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白质芯片组织芯片细胞芯片微阵列芯片芯片实验室（Lab-on-a-chip）正处于研究阶段芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。基因芯片（Gene chip） 又称为DNA

21、微阵列（DNA Microarray）或DNA芯片（DNA chip）。 将大量的基因探针分子固定于支持物上，然后与经过标记的样品DNA进行杂交，探针能够在基因混合物中识别出特定基因，最后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。基因芯片用途基因芯片用途表达谱芯片（最常用） 指纹图谱芯片 毒理芯片 诊断芯片 测序芯片 Affymetrix基因芯片的实验流程 2. 基因芯片技术流程基因芯片技术流程显微光蚀刻/压电打印/分子印章原位合成法探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA芯片微量点样法核酸提纯 扩增与标记 标记核酸纯化样品准备杂交与漂洗扫描与分析 基因芯片制备基因芯片制备 就

22、是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针，通过一定的方法固定到固相支持物上。 主要有两种：原位合成法和直接点样法原位合成法和直接点样法的比较 样品制备样品制备 与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。 生物素 常用标记物： 荧光素待测样品（用Cy3-dUTP 标记） 对照样品（Cy5-dUTP） 待测样品用待测样品用Cy3，发射，发射562nm红色红色荧光荧光对照样品用对照样品用Cy5，发射，发射664nm绿色绿色荧光荧光 以表达谱芯片为例：以表达谱芯片为例：I. 提取样本组织细胞中的提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性）（样本要新鲜并有代表性）II. 对提取出的对提取出的mRN