PCR与DNA测序

1、PCRPCR和和DNADNA测序技术测序技术Polymerase Chain Reaction(PCR(PCR，多聚酶链式反应，多聚酶链式反应) )特异片断的体外扩增技术特异片断的体外扩增技术无细胞克隆技术无细胞克隆技术(“free bacteria” cloning (“free bacteria” cloning techniquetechnique）1993年至今：年至今： 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程操作程序，使之迅速得到推广。序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的技术是

2、方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，一个里程碑，巨大的推动作用。巨大的推动作用。发展历程发展历程1983年，由年，由Cetus 公司的公司的Kary Mullis 建立建立 http:/ http:/ Saiki等在等在science上详细描述（人珠蛋白上详细描述（人珠蛋白DNA）1988年年 耐热的耐热的Taq DNA聚合酶聚合酶被发现和应用，把被发现和应用，把 PCR推向了实用推向了实用 阶阶段，成为段，成为PCR发展史上又一里程碑发展史上又一里程碑1989年，美国专利局授予年，美国专利局授予PCR技术专利；技术专利； PCR技术被技术被science杂志评选为伟大的技术发

3、明；杂志评选为伟大的技术发明； 1989年为年为DNA聚合酶的分聚合酶的分http:/ 获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖。类似类似DNADNA在细胞内的复制过程在细胞内的复制过程: : 由一对引物介导由一对引物介导, ,通过温度调节，使双链通过温度调节，使双链DNADNA变成单链（变性）；变成单链（变性）； 单链单链DNADNA能与引物复性（退火）成为能与引物复性（退火）成为 引物引物-DNA-DNA单链复合物单链复合物； 在在dNTPsdNTPs存在下，存在下，DNADNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNADNA（延伸）（延伸）PCRPCR循环：一

4、个循环：一个热变性热变性- -复性复性- -延伸延伸的过程。的过程。通常，通常，20-3020-30个循环之后，可获得大约个循环之后，可获得大约10106 6倍待扩增的倍待扩增的DNADNA片段的片段的拷贝。拷贝。什么是什么是PCR ? ?DNA在细胞内的复制过程aDNA在细胞内的复制过程bDNADNA复制过程中复制过程中,2,2条新生链都只能从条新生链都只能从5 5端向端向3 3端延伸端延伸, ,前导链连续合成前导链连续合成, ,滞后链分段合成滞后链分段合成. .DNA在细胞内的复制过程cDNA在细胞内的复制过程dDNA在细胞内的复制过程e1.PCR1.PCR的基本原理的基本原理在离心管中进

5、行的在离心管中进行的DNADNA合成扩增技术，合成扩增技术，模拟染色体的体内复制过程；模拟染色体的体内复制过程；与体内与体内DNA复制的不同之处：复制的不同之处： 耐热的耐热的TaqTaq酶酶取代普通的取代普通的DNADNA聚合酶聚合酶 用用合成的合成的DNADNA引物引物替代替代DNADNA引物引物 温度的调节：温度的调节：变性、退火、延伸变性、退火、延伸 反复循环，可使反复循环，可使DNADNA无限扩增无限扩增PCRPCR的第的第1 1个循环过程个循环过程PCRPCR的第的第1 1和和2 2个循环过程个循环过程PCRPCRPCR的第的第3 3个循环过程个循环过程PCRPCR技术的使用技术的

6、使用PCRPCR的标准反应程序：的标准反应程序：变性变性- -复性复性- -延伸延伸1)DNA1)DNA模板的解链（变性）模板的解链（变性） 90 95 ，30s 理论上，在理论上，在9090左右左右能使能使DNADNA双链之间的双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；所有氢键链断开，完全分离为单链； 且在且在中性中性pHpH情况下，情况下，DNADNA的完整性仍能很的完整性仍能很好保存好保存2)DNA 2)DNA 单链与引物的退火（复性）单链与引物的退火（复性） 55 65 ，3045s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单

7、链结合在一起不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNADNA引物的引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+ +模板几率模板几率DNADNA自身复性自身复性 几率几率 ）; 引物的最佳退火温度引物的最佳退火温度Tm-5 ，引物的量引物的量 引物的长度引物的长度3)3)引物的延伸（新链引物的延伸（新链DNADNA的合成）的合成） 7075 ，3060s （0.5mM 10mM1 unit25 100 l3. 影响影响PCR反应的因素反应的因素 ( 最适条件）最适条件） (1) (1)模板：将要被复制的核酸片段模板：将要被复制的核酸片段 DNADNA或或RNA

8、RNA（RNAcDNARNAcDNA） 较高的纯度较高的纯度：最好用纯化的最好用纯化的DNADNA样品，样品， （避免混有蛋白酶、核酸酶）。（避免混有蛋白酶、核酸酶）。 用量合适：用量合适：10102 210105 5分子数（分子数（100ng2kb2kb。(3)DNA(3)DNA聚合酶聚合酶a.a.大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶的的KlenowKlenow片断片断： 不耐热，每次循环需重加酶。不耐热，每次循环需重加酶。c. c. 其他聚合酶其他聚合酶b.Taqb.Taq酶酶（19881988年）年）：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性DNADNA聚合酶，聚合酶，

9、其活性需要其活性需要Mg2+Mg2+ 。 但但Taq-DNATaq-DNA聚合酶有一定错配率（无聚合酶有一定错配率（无3535外切酶活性，有外切酶活性，有5353外切酶活性），为外切酶活性），为0.1%-0.25%0.1%-0.25%（3030次次cyclecycle）；若要细胞）；若要细胞克隆克隆PCRPCR扩增的产物，进行表达，扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实扩增后必须测序证实才可使用才可使用CharacteristicsDescriptionOriginMolecular weightOptimal temperatureActivityStabilityFidelityMg2+

10、 concentrationExonuclease activityTransferase activityThermus aquaticus strain YT194 kd72-80150 nucleotides/sec/molecule50% at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM10mM5 to 3only5 adenosinesEnzymeMicrobial SourceThermotoleranceKlenowSequenaseTaqBstEPfuTthUlTmaEscherichia coliT7 bacteriop

11、hageThermus aquaticusBacillus stearothermophilusPyrococcus furiosusThermus thermmophilusTeratoga maritimaNoNoYesYesYesYesYesTth、Pfu、Vent聚合酶：聚合酶：具有校读功能。具有校读功能。 因为具有因为具有3-5外切酶活性，高保真扩增。活力要比外切酶活性，高保真扩增。活力要比Taq酶低。酶低。常用的常用的PCR技术技术v热启动热启动PCRPCRvTD-PCR(touch down PCR,TD-PCR)TD-PCR(touch down PCR,TD-PCR)v巢式巢

12、式PCRPCRv反向反向PCRPCRv锚定锚定PCRPCRv荧光定量荧光定量PCRPCRvRT-PCRRT-PCRv不对称不对称PCRPCR1 1、热启动、热启动PCRPCRv方法：方法： 退火之前，将退火之前，将DNADNA聚合酶与其他反应物隔绝聚合酶与其他反应物隔绝 或者使用在高热状况下才会活化的聚合酶或者使用在高热状况下才会活化的聚合酶v热启动热启动PCRPCR（hot start PCRhot start PCR） 一种改良的一种改良的PCRPCR方法方法 有效避免非特异性扩增有效避免非特异性扩增2、TD-PCRvTouchdown PCRTouchdown PCR，降落降落PCRPC

13、R。v退火温度常起始在高于计算的退火温度常起始在高于计算的TmTm值值1515左右，左右，v每一或每一或n n个循环降低个循环降低11（或（或nn）退火温度）退火温度，v直至达到一个较低的退火温度（常在直至达到一个较低的退火温度（常在TmTm值以下值以下55 ）。）。v以此温度进行以此温度进行1010多个循环多个循环。v用途：富集特异性产物用途：富集特异性产物3 3、巢式、巢式PCRPCR Nested PCR Nested PCRv两套两套PCRPCR引物引物 （巢式引物）（巢式引物）v两轮两轮PCRPCR扩增扩增4 4、反向、反向PCRPCRv普通普通PCRPCR只能扩增两端序列已知的基因

14、片段，只能扩增两端序列已知的基因片段，v反向反向PCRPCR则可扩增中间一段序列已知，而两端序则可扩增中间一段序列已知，而两端序列未知的基因片段列未知的基因片段5 5、锚定、锚定PCRPCRv锚地锚地PCRPCR技术是技术是 用于扩增已知一端序列的目的用于扩增已知一端序列的目的DNADNA。在未知。在未知序列一端加上一段多聚序列一端加上一段多聚dGdG的尾巴，然后分别用多聚的尾巴，然后分别用多聚dCdC和已知和已知的序列作为引物进行的序列作为引物进行PCRPCR扩增。扩增。6、RT-PCRv反转录反转录RCRRCR（reverse transcription PCR,RT-PCRreverse

15、 transcription PCR,RT-PCR）v实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR（real time PCR,RT-PCRreal time PCR,RT-PCR）7、RACE技术技术vRACERACE：快速扩增：快速扩增cDNAcDNA末端末端(Rapid Amplification (Rapid Amplification cDNA End)cDNA End)技术，获得全长技术，获得全长cDNAcDNA的快速有效的方法。的快速有效的方法。 vRACERACE法就是通过向法就是通过向cDNAcDNA末端加尾，根据末端加尾，根据已知序列已知序列和和加尾加尾 设计引物扩增设计引物扩增

16、获取获取cDNAcDNA末端未知序列的方法。末端未知序列的方法。v5 RACE 5 RACE 和和 3RACE3RACE的原理不一样的原理不一样Takara公司公司3 RACE和和 5 RACE 试剂盒原理试剂盒原理3RACE3RACE的局限性及注意事项的局限性及注意事项v33末端末端RACERACE相对容易，因为存在一个相对容易，因为存在一个poly(A)poly(A)，而且降解，而且降解常不是从常不是从3 3末端开始的。末端开始的。v局限性：局限性： 细菌和一些病毒的基因组的细菌和一些病毒的基因组的33末端通常没有末端通常没有polypoly（A A），），这个方法就不适用；这个方法就不适

17、用； 而且在有一些而且在有一些RNARNA中，这个中，这个poly(A)poly(A)也容易丢失也容易丢失 解决办法：可以通过解决办法：可以通过poly(A)poly(A)聚合酶在末端加聚合酶在末端加A A即可即可vRNARNA中加入中加入RNARNA酶抑制剂，很有利于保持完整的酶抑制剂，很有利于保持完整的RNARNA5RACE5RACE的局限性的局限性v通常，提取的通常，提取的RNARNA都会有些降解，而都会有些降解，而RNARNA的降解是从的降解是从55端开始的，所以用端开始的，所以用55末端磷酸化的末端磷酸化的RT-primerRT-primer去拉的时候，去拉的时候，55末端往往不全，

18、而且随着末端往往不全，而且随着RNARNA链的链的增长，比如几增长，比如几KbKb以上的，就更不能保证该引物能将以上的，就更不能保证该引物能将55末端拉全。末端拉全。Takara公司的公司的5RACE新方法新方法8、实时荧光定量、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR）v普通普通PCRPCR技术的定性和定量分析：技术的定性和定量分析： 定性：凝胶电泳的方法定性：凝胶电泳的方法 定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析 对象：对象：PCRPCR扩增的终产物扩增的终产物v普通普通PCRPCR技术的局限性

19、：无法获得技术的局限性：无法获得某一转基因动、某一转基因动、植物转基因的植物转基因的拷贝数拷贝数 或者或者 某一特定基因某一特定基因在特定在特定组织中的表达量组织中的表达量Real-time Q-PCRReal-time Q-PCRv简言之，利用荧光信号检测整个简言之，利用荧光信号检测整个PCRPCR扩增过程，获扩增过程，获得在线描述得在线描述PCRPCR过程的动力学曲线过程的动力学曲线v特点：可以对特点：可以对DNADNA模板进行定量分析模板进行定量分析 具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、 能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、能实现多重反应、自动化程度高

20、、无污染性、 具实时性和准确性等特点。具实时性和准确性等特点。v实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术 是一种在是一种在PCRPCR反应体系中加入荧光基反应体系中加入荧光基团团, ,利用荧光信号积累实时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。曲线对未知模板进行定量分析的方法。RT-Q PCR 的应用的应用mRNAmRNA表达的研究，表达的研究，DNADNA拷贝数的检测，单核苷酸拷贝数的检测，单核苷酸多态性（多态性（SNPsSNPs）的测定，）的测定，病原体的检测，肿瘤病原体的检测，肿瘤诊断，基因突变、多态性及表

21、达的研究，遗传诊断，基因突变、多态性及表达的研究，遗传疾病的诊断疾病的诊断RT-Q PCR 存在的问题存在的问题v在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品；在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品；v实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了它的应用能力；它的应用能力；v研究研究mRNAmRNA时，受到不同时，受到不同RNARNA样本存在不同的逆转录（样本存在不同的逆转录（RTRT）效）效率的限制；率的限制；v相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内源控制物

22、的选择也是实验结果可靠与否的关键；源控制物的选择也是实验结果可靠与否的关键；v不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）；不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）；DNA序列测定序列测定DNA测序技术的诞生和发展测序技术的诞生和发展v1980年， Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖 ）v1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977)v1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger 发明双脱氧链终止法DNA

23、测序技术(Sanger和Coulson)，迄今为止DNA测序技术的诞生（第一代测序技术的诞生（第一代DNA测序技术）测序技术）vSangerSanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止迄今为止DNADNA测序的主流。测序的主流。v第二代测序技术（第二代测序技术（Next-generation sequencing)Next-generation sequencing)：费：费用更低、通量更高、速度更快用更低、通量更高、速度更快。第二代第二代DNA测序技术测序技术v现有的技术平台主要包括：现有的技术平台主要包括：Roche/454 FL

24、X、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和和 Applied Biosystems SOLID system。v三个技术平台各自的优点：三个技术平台各自的优点：v454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到）能达到400bp；vSolexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的测序的1/10；vSOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于测序的准确度高，原

25、始碱基数据的准确度大于99.94%，而在，而在15X覆盖率时的准确度可以达到覆盖率时的准确度可以达到99.999%，目，目前第二代测序技术中准确度最高。前第二代测序技术中准确度最高。v核心思想：边合成边测序（核心思想：边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。的序列。v例如，例如，Illumina/Solexa Genome AnalyzerIllumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理：测序的基本原理：在在SangerSanger等测序方法的基础上，通过技术创

26、新，用不同颜色等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的的荧光标记四种不同的dNTPdNTP，当，当DNADNA聚合酶合成互补链时，聚合酶合成互补链时，每添加一种每添加一种dNTPdNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNADNA的序列的序列信息。信息。vDNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的双脱氧法双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序19771977年年Sanger Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法利用此原理建立了双脱氧测序法原理：与加减法相似，但不再是加一种原理：与加减法相似，但不再是加一种dNTPdNTP或减一种