质粒提取和酶切分析

1、 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切分析的限制性内切酶酶切分析1. 实验目的实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性、学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法切的原理和方法 ，并理解限制性内切，并理解限制性内切酶是酶是DNA重组技术的关键工具。重组技术的关键工具。 2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。 上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性

2、内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。 1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不

3、能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类： 型 型* 型第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定

4、长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链

5、上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：平头末端：异源同工酶：又称同裂酶有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（或同切酶）。同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内

6、切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5G|CG G33G GC|G53） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。同尾酶：同尾酶：如Xba1和Nhe1: 5T|CTAGA3 5G|CTAGC3 3AGATC|T5 3CGATC|G5 5T CTAGA3 5G CTAGC3 3AGATC T5 3CGATC G5 5TCTAGC3 3AGATCG5 这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切

7、识别位点为GATC)来进行再切割。4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。3. 酶切反应的设计一般应注意问题酶切反应的设计一般应注意问题: : 1) 大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12时，某些限制酶

8、的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。 2) 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该尽量消化去除。3) 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。 4) 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。5) 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的

9、BSA，可维持酶的稳定性。酶单位定义酶单位定义:活性单位：活性单位： 在最适反应条件下在最适反应条件下(温度、温度、PH值、离子值、离子浓度）浓度）1小时内完全酶切小时内完全酶切1g特定特定DNA底物所需的底物所需的限制酶的量。限制酶的量。4. 酶切实验中的注意事项酶切实验中的注意事项: :1) 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。2) 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 3) 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。4) 终止酶反应可根据需要采用不同的方法： 酶切后不需进行下一步反应，

10、可加入含EDTA的终止液终止反应。 若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。4. 酶切实验设计的一般思路酶切实验设计的一般思路: : 软件检测目的需要转移操作的目的基因片段含有的酶切位点情况，选择基因内部不存在的内切酶。 确定双酶切的通用buffer 确定内切酶的最适用量和酶切时间 进行酶切实验3. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器质粒：重组质粒BamH核酸内切酶（Takara）酶解缓冲液(10K buffer)离心机，水浴锅10ml微量移液器，无菌的0.5mL EP管4. 实验方法和步骤实验方法和步骤 Tota

11、l ddH2O 10Buffer BamH DNA(50ng/ml)10ml 7.2ml 1ml o.8ml 1ml2) 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶解的限制性内切酶酶解1) 质粒中质粒中RNA的酶解的酶解 向30ml质粒溶液中加入10mg/mL Rnase 2ml， 37水浴酶解0.5小时。 置于30水浴酶解3小时。酶解完成后，分别进行电泳分析。Sac1 4-12U/Sac1 4-12U/m ml lXba1 8-20U/Xba1 8-20U/m ml lDNADNA限制性内切酶对基因组限制性内切酶对基因组DNADNA完全酶切的酶量完全酶切的酶量和所用的时间是负相关的和所用的时间是负相关的

12、如如Xba1:Xba1:50U50U完全酶切需要完全酶切需要5h, 5U5h, 5U完全酶切则需要完全酶切则需要20h20h 碱裂解法小量制备质粒碱裂解法小量制备质粒DNA一实验目的及背景一实验目的及背景质粒图谱的阅读质粒图谱的阅读质粒特点质粒类型质粒的应用分离质粒DNA方法碱裂解法基本原理实验试剂实验试剂q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液三实验方法三实验方法 四、结果检测1. 1.菌体老化菌体老化2.2.碱裂解不

13、充分碱裂解不充分3.3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.4.溶液使用不当溶液使用不当1. 1.请涂布平板培养后，重新挑请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养选新菌落进行液体培养2.2.可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要频繁转接，每次接种时不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。使用浓度是否正确。4.4.溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊，置于现浑浊，置于3737保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液直至溶解为清亮的溶液。q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原原因因对对策策1. 1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因组混有基因组DNADNA1. 1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.加入加入RNaseARNaseA室