蛋白质测定-凯氏定氮法

1、【基础知识基础知识】蛋白质概述蛋白质概述蛋白质是食品营养价值的重要指标，含蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量接近，一般来说，接近，一般来说，pro的平均含氮量为的平均含氮量为16%，即一份，即一份氮相当于氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。注意：注意：不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为青豆、鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大米为，大米为5.95，大，大豆

2、及其制品为豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为；硬果类为5.30；牛乳及其牛乳及其制品为制品为6.38。【一、实验目的一、实验目的】 1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。 2、学会使用凯氏定氮装置。、学会使用凯氏定氮装置。 3、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。蛋白质是食品营养价值的重要指标。测量食品中蛋蛋白质是食品营养价值的重要指标。测量食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利白质的含

3、量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提高产品用食品资源、指导生产、优化食品配方、提高产品质量具有重要的意义。质量具有重要的意义。注意注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为故称为粗粗pro。【二、原理二、原理】1、消化、消化仪器及试剂的准备仪器及试剂的准备仪器：仪器：【三、实验步骤三、实验步骤】试剂试剂作用作用硫酸铜硫酸铜a催化作用催化作用：加速有机物的氧化分解。：加速有机物的氧化分解。b消化完全的指

4、示剂消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾硫酸钾提高溶液沸点提高溶液沸点，从而加快有机物分解，从而加快有机物分解 浓硫酸浓硫酸氧化作用氧化作用：有机物质氧化分解为：有机物质氧化分解为H2O和和CO2样品预处理样品预处理固体试样固体试样 0.22g半固体试样半固体试样 25g液体试样液体试样 1025g样品充分混匀样品充分混匀直接消化直接消化样品称量、消化样品称量、消化1.000g1.000g奶粉奶粉0.2g0.2g硫酸铜硫酸铜6g6g硫酸钾硫酸钾20mL20mL浓硫酸浓硫酸

5、玻璃珠玻璃珠小火加热炭化小火加热炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止轻摇轻摇 大火加热大火加热保持瓶中液体微沸保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明至蓝绿色澄清透明继续加热继续加热0.51h冷却冷却加加20mL水水冷却冷却同时做试剂同时做试剂空白试验空白试验2、蒸馏、吸收、蒸馏、吸收仪器及试剂的准备仪器及试剂的准备仪器：仪器：100mL 3只只 试剂（混合指示剂）：试剂（混合指示剂）： 2 2份份甲基红乙醇甲基红乙醇液（液（1g/L1g/L）与）与1 1份份亚甲基蓝乙醇亚甲基蓝乙醇液（液（1g/L1g/L）临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色绿色, ,在中性溶液中呈在中性

6、溶液中呈灰色灰色, ,在酸性溶液中呈在酸性溶液中呈红色红色。凯氏定氮蒸馏装置凯氏定氮蒸馏装置传统装置传统装置1：电炉：电炉2：水蒸气发生器：水蒸气发生器3：螺旋夹：螺旋夹4：小玻杯及棒状玻塞：小玻杯及棒状玻塞5：反应室：反应室6：反应室外层：反应室外层7：橡皮管及螺旋夹：橡皮管及螺旋夹8：冷凝管：冷凝管9：蒸馏液接收瓶：蒸馏液接收瓶水蒸气发生器：水蒸气发生器：装水至装水至2/32/3处，加入数粒处，加入数粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基红乙醇甲基红乙醇指示剂指示剂数滴及数滴及硫酸硫酸数数mlml，使水呈微红色（保持酸性，使水呈微红色（保持酸性以防水中氨的逸出）以防水中氨的逸出）按上图所示搭好装置按上

7、图所示搭好装置蒸馏及吸收蒸馏及吸收n10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液100mL100mL三角瓶三角瓶加加1 12 2滴混合指示剂滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下冷凝管下端插入三角瓶液面下准确吸取准确吸取10mL10mL试样试样由由小玻杯流入反应室小玻杯流入反应室少量水洗涤小漏斗少量水洗涤小漏斗盖紧玻璃塞盖紧玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液倒入小玻杯倒入小玻杯提起玻塞使其缓提起玻塞使其缓慢流入反应室慢流入反应室立即塞紧玻璃塞立即塞紧玻璃塞加水于小玻杯防漏气加水于小玻杯防漏气 通蒸汽通蒸汽颜色变化时开始计时蒸馏颜色变化时开始计时蒸馏5min 5m

8、in 移动接受瓶使移动接受瓶使液面离开冷凝管下端液面离开冷凝管下端再蒸馏再蒸馏1min1min 用少量水冲洗冷凝用少量水冲洗冷凝管下端外部管下端外部取下接收瓶取下接收瓶注意注意加加NaOH一定要过量一定要过量，此时溶液生成，此时溶液生成深蓝色深蓝色或黑色或黑色沉淀沉淀为为防止样液中氨气逸出。防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象硼酸吸收液的颜色硼酸吸收液的颜色反应室中溶液的颜色反应室中溶液的颜色 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能

9、蒸馏。吸收液温度不应超过吸收液温度不应超过4040，避免氨气逸出，避免氨气逸出，若超过若超过时可置于冷水浴中使用。时可置于冷水浴中使用。 在蒸馏时，在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得，蒸馏过程中不得停火断汽停火断汽, ,否则会发生否则会发生倒吸倒吸。 蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1 1分钟，分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，收瓶移开，最后关闭电源最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生则吸收液将发生倒吸倒吸。所用的试

10、剂溶液所用的试剂溶液 必须用必须用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制。配制。 3、盐酸滴定、盐酸滴定接收瓶接收瓶 以以HCL标准滴定液滴定标准滴定液滴定 灰色终点灰色终点 记录记录VHcl（1 1）硼酸吸收液的）硼酸吸收液的颜色颜色（2 2）吸收氨气后的）吸收氨气后的硼酸吸收液的颜色硼酸吸收液的颜色（3 3）盐酸滴定终点）盐酸滴定终点的颜色的颜色项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据内容内容1 12 23 3 空白空白样品质量样品质量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V终终 / / mLmL消耗的体积消耗的体积V V1 1 / /mLmL吸取消化液体积吸取消化液体积V V

11、3 3 /mL/mL蛋白质含量（蛋白质含量（g/100gg/100g）平均值（平均值（g/100gg/100g） （g/100gg/100g） F F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.386.38【四、数据记录与计算四、数据记录与计算】n有效数字：有效数字：n蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留三位三位有效数字有效数字n蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留两位两位有效数字。有效数字。n精密度：精密度：n在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的过

12、算术平均值的10%（g/100g）小结小结步骤步骤反应前后颜色变化反应前后颜色变化湿法消化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）加硫加硫酸炭化黑色酸炭化黑色消化后红棕色消化后红棕色 棕褐色棕褐色消消化终点蓝绿色化终点蓝绿色/ /墨绿色墨绿色淡蓝色（冷却后溶淡蓝色（冷却后溶液）液）碱化蒸馏碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫红色紫红色绿色绿色盐酸滴定盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色灰色灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色蓝紫色蓝紫色n凯氏定氮法用于所有动物、植物类食

13、品的蛋白质含量的凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。粗蛋白质含量。n若要测定样品的蛋白氮若要测定样品的蛋白氮, ,则需要向样品中加入则需要向样品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶溶液液, ,使其最终浓度为使其最终浓度为5%,5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量, ,进一步计算出蛋进一步计算出蛋白质

14、含量白质含量: : 蛋白氮蛋白氮= =总氮总氮- -非蛋白氮非蛋白氮l准确称取某乳粉样品准确称取某乳粉样品0.8000.800克，经凯氏法消化定容至克，经凯氏法消化定容至100ml100ml，移 取移 取 5 m l5 m l消 化 液 进行蒸馏 ， 用消 化 液 进行蒸馏 ， 用 2 0 m l2 0 m l 硼 酸 吸 收 ， 再 用硼 酸 吸 收 ， 再 用0.05000mol/lHCl0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗滴定，结果消耗5.00ml5.00ml，试计算该乳粉的，试计算该乳粉的蛋白质含量？蛋白质含量？l试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消试述蛋白质测定

15、中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？l样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？须采用什么措施？知识拓展：三聚氰胺假蛋白知识拓展：三聚氰胺假蛋白“原理原理”三聚氰胺的三聚氰胺的“优点优点”1、普通蛋白质含氮量平均为、普通蛋白质含氮量平均为16%，一般不超，一般不超过过30%，而三聚氰胺含氮量为，而三聚氰胺含氮量为66.7。2、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易被检测出来被检测出来若以合格奶粉蛋白质含量为若以合格奶粉蛋白质含量为18%计算，则含氮量为计算，则含氮量为2.88%。三聚氰胺含氮量是牛