利用多重PCR鉴定西瓜杂交种纯度

1、利用多重PCR鉴定西瓜杂交种纯度利用多重PCR鉴定西瓜杂交种纯度2871202102-017-05IdentificationofpurityofwatermelonhybridsbymultiplexPCRYANGHuihui1，LIHewei1，ZHAOYongwei2，YUANShengkai1，2，YANGLuming1，HUJianbin1，SUNShouru1，MAChangsheng1，2，ZHUHuayu11.CollegeofHorticulture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，Henan，China;2.Henan

2、YuyiSeedIndustryTechnologyDevelopmentCo.，Ltd.，Zhengzhou450002，Henan，ChinaAbstract：Inordertoquicklyandefficientlyidentifythepurityofwatermelonhybrids，acompleteSSRmolecularmarkeridentificationsystemwasestablished.Inthisstudy，192pairsofSSRmarkerscoveringthewholegenomeofwatermelonwereusedtoscreenpolymor

3、phismsofthesmallfruitwatermelonvarietyJinxiaNo.8，and36bandswithclearandpolymorphicSSRmarkerswereobtained，thepolymorphismratewas18.8%，andthesemarkerswerelocatedonchromosomes1，2，3，4，5，6，8，10，and11，respectively.Basedontheamplifiedfragmentsizeofthesepolymorphicmarkers，4pairswereselectedfordoublePCRandtr

4、iplePCRgroupamplification，andthedoubleandtriplePCRpurityidentificationsystemsofJinxiaNo.8hybridsweresuccessfullyestablished.Theresultsofthethreepairsofmarkerswerebasicallyconsistent，andthepurityoftheJinxiaNo.8hybridwas100%.Theresultsofmarkeridentificationwerehighlyconsistentwiththoseoffieldmorpholog

5、icalidentification.Forthefirsttime，thetriplePCRtechniquewasusedtoidentifythepurityofwatermelonhybrids，whichlaidasolidfoundationfortheefficientandrapididentificationofwatermelonhybrids.Keywords：Watermelon;Moleculermarker;MultiplexPCR;Purityidentification西瓜Citrulluslanatus为葫芦科西瓜属一年蔓生草本植物，是世界上重要的园艺作物之一

6、。中国是西瓜最大的生产和消费国，西瓜栽培历史悠久。在育种过程中，因品种鉴定所需周期较长，费用较高，且鉴定的结果具有不确定性，所以种子的纯度鉴定是一项难题，而种子的质量直接影响农产品的品质及农民的收益，因此，对杂交种进行纯度鉴定以保证种子质量及生产效益是极其必要的1。常用的种子纯度鉴定方法有形态学鉴定和分子鉴定。传统的形态学鉴定易受环境、气候和人为因素的影响，且存在费时费地费劲等缺点2。利用分子标记技术能够从DNA水平上检测杂交种和亲本之间的差异，克服了空间的限制，极大缩短了检验所需时间3。目前常见的分子标记有RAPD标记、SRAP标记、EST-SSR标记等，但是利用这些标记进行纯度鉴定具有局限

7、性，而SSR标记具有数量丰富、共显性遗传、重复性好、操作简便等优点，适于进行杂交种纯度的鉴定4-5，如孙波等6利用SSR分子标记技术对西瓜品种雪龙三号进行种子纯度鉴定，鉴定结果验证了西瓜品种的真实性。但是讨论者多数是利用单一PCR扩增鉴定品种真实性，此做法虽然可以区分出亲本自交株，但是对于品种间的机械混杂则难以区分。3商量与结论目前市场上销售的西瓜种子均为杂交一代，种子纯度是其质量的重要指标之一13。根据国家标准的规定，西瓜杂交品种的纯度必需高于95%14。在人工生产种子的过程中，母本去雄不彻底、机械混杂和生物学混杂等缘由都会降低种子纯度。综合前人对西瓜品种纯度鉴定的讨论，多数讨论者利用单一的

8、PCR扩增确定品种的真实性，虽然可以区分出亲本自交种，但对品种间的机械混杂鉴定存在局限性。前人证明了SSR分子标记技术的可行性15。孙波等6利用23对SSR核心引物对西瓜品种进行纯度鉴定，其结果充分说明了SSR分子标记鉴定品种纯度的可靠性。张佩伦等16利用SSR標记对4个西瓜品种进行纯度鉴定，其结果与田间形态学鉴定结果高度一致。利用单一引物进行杂交种纯度鉴定时，多数讨论者大多实行热碱法、SDS法等快速提取植物基因组DNA的方法;但是利用多重PCR进行鉴定时多数讨论者则是实行CTAB法提取DNA17-18;常宏等19在对玉米种子真实性的鉴定中得出，相比较CTAB法和热减法提取的DNA，CTAB法

9、提取的DNA质量较高，且电泳结果主带较清晰;而热减法提取的DNA质量较差，主带出现严峻拖尾。胡倩梅等9利用碱裂法提取甜瓜叶片DNA，构建多重PCR体系，发觉利用4对引物同时进行扩增时会影响推断条带的精确性，添加2对和3对引物可以精确推断引物扩增出的条带。所以，对于粗提DNA的方法是否可以应用到多重PCR鉴定西瓜纯度，有待于进一步讨论。笔者通过对覆盖西瓜全基因组的192对引物进行筛选，36对引物在锦霞八号及其亲本之间具有多态性，多态性比率为18.8%，从中选择4对位于西瓜不同染色体上的SSR标记检测锦霞八号纯度。通过构建双重和三重PCR体系，对锦霞八号杂交种进行纯度鉴定，双重PCR结果和三重PCR结果基本吻合。分子鉴定结果与田间鉴定结果高度一致，与前人讨论结论一致。利用SSR分子标记技术对西瓜杂交种进行纯