临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3

1、临床基因扩增检验标本的处理、保存临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制和核酸提取方法及质量控制童永清童永清武汉大学人民医院临床分子诊断中心武汉大学人民医院临床分子诊断中心武汉大学人民医院检验医学中心武汉大学人民医院检验医学中心核酸扩增检测标本核酸扩增检测标本采集、运输、存储的重要性采集、运输、存储的重要性n临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节n解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一核酸提取的重要性核酸提取的重要性n核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分n核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与

2、否n临床PCR检验操作中最易出问题的环节分析前质量控制分析前质量控制标本采集、转运、预处理、储存等标本采集、转运、预处理、储存等n标本采集、运送和保存标本采集、运送和保存p早早 特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本p快快 标本应尽快送检，不能及时检测的标本放入低温容器内送检。短时标本应尽快送检，不能及时检测的标本放入低温容器内送检。短时 间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融p近近 标本应尽量取自病变部位或接近病变部位标本应尽量取自病变部位或接近病变部位p多多 标本的量不能太少标本的量不能太少p净净 避免污染标本避免

3、污染标本标本采集标本采集n标本采集时间对扩增检测结果的影响 n标本采集部位的准备 n标本的类型和采集量 n采样质量的评价 n采样及运输容器 n标本采集中的防污染 标本运送标本运送 n样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。n样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。n实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。检测标本类别检测标本类别全血标本标本血浆血清骨髓骨髓活检活检组织组织腹水腹水胸水胸水石蜡石蜡切片切片分泌分泌物物新鲜新鲜组织组织毛囊有目有目的地的地选择选择标本标本类别

4、类别标本采集器皿标本采集器皿标本采集器标本类型决定标本采集器n标本采集标本采集n外周血（外周血（HBV/EBV-DNA、HCV-RNA、HLA分型等分型等 ）p抗凝剂使用：首选抗凝剂使用：首选EDTA或枸橼酸钠，不可使用肝素（强烈抑制或枸橼酸钠，不可使用肝素（强烈抑制PCR反应），不可溶血反应），不可溶血pRNA 检测：及时分离血浆，置于无检测：及时分离血浆，置于无RNase 的离心的离心管中送检管中送检pEBV-DNA检测检测（小心使用）（小心使用）：小心分离：小心分离LC，避免混入，避免混入RBCn标本采集标本采集n其他体液（其他体液（TB/EBV-DNA等病原）等病原）n痰：深部痰液，不

5、是唾液痰：深部痰液，不是唾液n胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂n尿液：尿道口消毒，中段尿尿液：尿道口消毒，中段尿n鼻咽部：咽后壁分泌物鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNAn分泌物（分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）等病原）n采样时要采到上皮细胞采样时要采到上皮细胞n充分洗涤拭子充分洗涤拭子切片组织标本采集切片组织标本采集n肿瘤组织40%：直接提取核酸n肿瘤组织血清血清10倍）倍）2、阴性结果解读：、阴性结果解读：DNA阴性并非无感染，判断阴性并非无感染，判断 是否感染是否感染 需要进行需要进行HBsAg检测检测3、什么时候需要检测、什么时候需要检测HBV-DNA：a、

6、 HBsAg(+)，需要判断，需要判断HBV在体内复制情况在体内复制情况b、乙型肝炎患者在治疗过程中疗效监测、乙型肝炎患者在治疗过程中疗效监测大三阳患者HBV-DNA阴性率5-10%小三阳患者HBV-DNA阴性率30%左右48丙型肝炎流行丙型肝炎流行n丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因n全球约1.2亿人感染HCV,流行率2%n我国HCV的感染率约为3.2%，约3800万HCV感染者n每年新发丙型肝炎病例约3.5万例-WHO 丙型肝炎检测丙型肝炎检测注意事项：注意事项：a、血浆血浆、血清、血清b、及时送检，不能及时检测时，放置与、及时送检，不能及时检测时，放置与-20

7、c c、抗体检测阳性时，、抗体检测阳性时，HCV-RNA(+),有感染；抗体有感染；抗体检测阴性时，不一定未感染，需检测检测阴性时，不一定未感染，需检测HCV-RNA 肿瘤的分子诊断肿瘤的分子诊断实例实例2N Engl J Med. 2011; 365:158-167非小细胞肺癌分子分型非小细胞肺癌分子分型Mod Pathol. 2008;21 Suppl 2:S16-22Mod Pathol. 2012;25(3):347-69J Clin Oncol. 2013;31(8):1081-8不同化疗方案之间的疗效不同化疗方案之间的疗效组织标本的质量控制组织标本的质量控制组织足够组织足够 HE染色，形态学检测染色，形态学检测组织量不够时组织量不够时 (1)基因检测：基因检测：EGFR、ALK等等 (2)免疫组化：区分腺癌和鳞癌，同时鉴别是否转移免疫组化：区分腺癌和鳞癌，同时鉴别是否转移 和其它类型的肺癌和其它类型的肺癌 p63（鳞癌）；（鳞癌）； CEA, B72.3, Ber-EP4, MOC31, CD15, and TTF-1（腺癌）（腺癌） CD56, chromogranin, synapt