MASSARRAY原理培训讲学

1、MASSARRAY 原 理精品资料MassARRAY图1MassARRAY系统由美国Sequenom公司开发，在癌症研究、遗传学分析、分 子诊断和药学等领域已经得到越来越广泛的应用，受到全球多个顶尖研究中心 的推崇。应用领域 飞行时间质谱技术搭配不同Sequenom的检测和软件模块，可以在一个平台上 实现以下技术：SN吩型以及SNpi点等位基因频率计算体细胞突变检测和分析甲基化定量分析基因表达定量分析CNV测分析寡核甘酸质量控制和检测检测服务流程客户提供DNAg；者各类生物样本以及检测位点信息样本完整性检测以及前处理引物设计、合成PCFT增、SAP纯化、延伸或转录裂解点样质谱分析分析报告SNP

2、分型1、技术名称Sequenom MassARRAY SNP 基因型分析技术MassARRAY 术流程：取样.样品制备g pcr反应国扩增纯化9引物延伸纯化S点样质谱分析E1分型报告仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢7样品样品制备PCR反应犷增纯化分型报告质谱碓点样用物延怦(即延伸出所要研究的5XP位点的单个碱基2、技术原理Sequenom SNP 检测系统基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术。主要特点是，PCR扩增后的产物，加入 SNP序列特异延伸引物，在 SNP位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的

3、真空管，而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF )检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。理论上讲，只要飞行管长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。MASSARRAY SNP 检测的质谱范围为5000 到8500 DaltonU巾Drift region-

4、 IgH birw图2isnp通厅”期的说划小京I他昨ntf 十 ddKEAllele 2而冲H即e一qJe”I:rwwWrnw 7<"-nfrSiimirtf m*r rr-rjcj；1： .一i. . U' .H：和:”.用:i Jib1.图2:飞行时间质谱法对 SNP进行分型的原理示意图精品资料质谱检测3、 技术特点灵活： 可以自由选择感兴趣的 SNP位点 一张芯片上，样本的数量和位置可以自由选择 一张芯片上，样本和 SNP位点的配对可以自由选择准确： 直接检测待测物分子量，准确度超过99.7% 质谱技术灵活检测 PCR实验失败或三等位基因的存在高通量："

5、;一张芯片上可完成 384个样品的多重iPLEX GOLD实验 每个反应孔可实现多达 40重反应 每天最多能进行十万个基因型分析性价比高："无需荧光标记，成本大大降低即便在低通量的情况下每个基因型分析的成本仍然很低4、优势:(1)质谱仪检测的是分子最本质的特征之一一一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；(2)质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；(3)通量高：几秒就能检测完一个反应孔；(4)操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；(5)灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；

6、(6)便宜：引物不带荧光标记，普通长度(3条引物总长80bp左右)，此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的 4重反应；(7)兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。(8)质谱技术是 1管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。甲基化研究DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿 瘤发生中起着重要作用。MassARRAY分子量阵列基因分析系统 EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF测序原理。两者

7、的完美结合使得该技术成为高准确性、高通量及高灵敏度的DNA甲基化定量分析手段。MassARRAY分子量阵列基因分析系统 EpiTYPER DNA甲基化分析技术是高通量 DNA甲基化定量技 术。实现多重CpG的甲基化位点的定位定量检测。配套的 EpiTYPER软件为用户提供便捷的数据分析和报告工具。实验原理：碱基特异fiE酶切（MassCLEAVE ）实验从亚硫酸盐处理待测 DNA开始。经过亚硫酸盐处理 DNA中的未甲基化的胞嗑咤（C）转变为 尿嗑咤（U）,由此在DNA模板中产生了甲基化特异的序列变化。利用 5末端带有T7-启动子的引物进行 PCR扩增。产物经虾碱性磷酸酶（SAP）处理后用于碱基

8、特异性的酶切反应。酶切后 DNA片段的大小和 分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化。配套软件EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。图原理流程仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢9精品资料1U；IL j般求西卵FL-数据处理与输出EpiTYPER软件系统提供先进方便的 DNA甲基化定量分析手段。该软件系统提供数字和图像注释工 具，并能将实验数据与客户提供的DNA序列相吻合。作为内在的质量控制机制，该系统还包括了基本统计学分析方法及数据可靠程度的评估手段。仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢11SpectrumEpiGramSequence所嘀 -, «-&

9、#187; -9-9-v-«- ，-4-M-<-»-» n * -ntfi -"f* -«-M *1 > -T-. - «-M-_ .- Cl! * 中- 0 * - 一J 一 M事->-<ro-»-c &-C®O-JK -8-©4B-lOrmh *iHQtt一 Q»HH c0-QV CO 40-04-0-UMfr 妫耐«-001(_ OHW 0-04-0"1 心Snti -MD0frSJ。QQI0909MOO-®-C -0CH)-T

10、f -图EpiTYPER软件分析示意图精品资料1 Sir (clone ij151(50-50 ID-1)25 % methylated100 % methylated0 % methylated0jC17jSLnM 10-1) (.EirjSUi 275101)图：甲基化程度质谱原始图平台优势：高性能一一能够分析覆盖长达600bp内的多个CpG位点，能够分析福尔马林处理的石蜡组织，无需任何 荧光标记。高精度和高准确性一一准确地进行甲基化定量从 10%到90%,标准差只有5% ,不同实验室的实验结果可 比性强、可重复性高。高性价比一一用384孔板进行PCR反应，反应容积小节省试剂，一个扩增产物

11、可以进行多个CpG位点分析。操作简单一一无需设计CpG位点特异性引物，无需进行 PCR产物纯化，研究几个到几百个甲基化位点的 理想手段，全自动标准化软件和数据报告形式使不同样本的比较简便易行。CNV定量检测在牛命体中很多时候基闪序列没有发生突变，而是基因拷贝 数发生改变，一段基因序列发生缺失或搏贝数增加，异致基因表 运产物较少或增加，产生表型差异口也就是基闪剂量效应：基因 没有序列突变,血是基因数量发生缺失或上升，导致表型差异* 这就是拷贝数差异，copy number vatiation3基因拷贝数多态（CNV）是造成个体差异的重要遗传基础，也是近来基因组学的 研究热点。目前已有超过160万

12、个专为基因组拷贝数变异或更小的基因组区域 变异检测而优化设计的TaqMan ? CNV预制试剂盒，结合ABI 7900实时定量 PCR,可对检测样本进行目标基因（具有拷贝数多态）以及参照基因（没有拷 贝数多态）拷贝数定量分析，通过比较两个检测值的比值可以检测样本的候选 基因的拷贝数。检测原理rrrrmmiIL口！MA rm，。加nh CompetitorPCR AmviiriciionPr r7ier EAPymk Arg N com pjirisonOe?hi E jif AAC»42DO5i|实验流程FAM-iabeied TEST ASSAYTaqMan* GTMaxtor M

13、ixCopy number匚不皿1 x 2D«U nnnW$i,with CopyCaller IgDNA1Qng f PCR nonDuplex TaqMan 1(1 5 hr) I4 rephcates per sampleCNV检测的重要性：与遗传病，如癌症，免疫疾病和神经系统疾病等基因组水平的异常相关基因计量效应具有相应的表型CYP2D6基因的拷贝数多态性与药物代谢表型关联仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢15精品资料CCL3L1基因的拷贝数多态性影响人对HIV/AIDS病毒的易感性! -?C""Tt3nnorsnr 6仅供学习与交流，如有侵权请联

14、系网站删除 谢谢19丫曲苫 of genom k； structuRI changes atteciingsegments of DU A that read io dHTmeft typesvariaiions检测方法:CNV检测方,法全基因组也测CNV,发现新CNV, CNV区域mapping 高密度基囚组芯片aCGH array f Tiling Array等 Fosimid末端配对序列观察CNV在染色体分布情况是否多位点，是否跨染色体）-FISH.针对特点靶目标CNV定量精确检测-TaqMan real-time PCR （定量检测金标准TaqMan Copy number Assay

15、s）-SYBR Green real-time PCR难以精确区分微量措贝数差异；无法同管做内参府照，检测都以准确）MLPA（峡点：难以精确区分微量拷贝数差异;设计制约多 ,引物难以设计）技术优势?具有高度特异性和高重复性的TaqMan CNV分析技术。?超过160万预合成的CNV检测试剂盒，可用于检测已知基因、已知 拷贝数变化区域和非编码基因区域。?可根据客户需求采用ABI成熟的算法灵活设计CNV检测试剂盒。参考文献1. Gonzalez, E., et al., The Influence of CCL3L1 Gene-Containing Segmental Duplicationson

16、 HIV-1/AIDS Susceptibility, Science. 2005, 307(5714):1434-14402. Rose-Zerilli MJ, et al., Copy-number variation genotyping of GSTT1 and GSTM1 genedeletions by real-time PCR, Clin Chem . 2009 55(9): 1680-1685知名用户Sequenom MassARRAY评台应用先进的质谱技术，为基因组学的研究提供了无与伦比的灵敏度和特异性，被认为是行业内的金标准，该平台已在全球卖出300多台，被广泛应用于全球

17、顶尖的基因研究机构，例如：美国国立卫生研究院，哥伦比亚大学医学中心，英国 Sanger中心，日本东京大学，香港大学，香港 中文大学，台湾中央研究院，上海瑞金医院血液病研究所，中科院北京基因组所，等等。科研成果Sequenom以其卓越的解决方案赢得了全世界科学家的认可。利用sequenom优秀的技术平台和解决方案，科学家们在以下各个领域已经或即将取得瞩目的进展和应用。医学SNP是继人类基因组测序完成后人类基因组研究的又一重要研究领域。大量优秀的文章和研究成果获得。尤其是在SNP与疾病发病的关联性方面取得很大的进展。我国科学家也取得了优秀的成绩。如协和医科院 的林东欣教授在肺癌研究的成果和安徽医科

18、大学张学军教授在银屑病方面的研究成果均发表在naturegenetics » 杂志上。1、肿瘤发病及其相关 SNP研究和肿瘤的诊断。肿瘤的发生是多种因素的共同作用。既有环境因素的影响，又有个体内在的易感性。这些易感性尤其体现在SNP上。众多研究成果都日益证明SNP与肿瘤的发生发展关系密切。Sequenom系统在GWAS1的大样本量的验证方面发生了重要作用。如Tong Sun et al. NATURE GENETICS 2007 , 39 (5) : 605-613中国医学科学院的林东欣教授实验室和北京基因研究所的曾长青教授实验室联合研究了肺癌发病与SNP 相关性，发现在CASP8启

19、动子上存在的6碱基缺失与肺癌的发病风险存在相关性。采用 sequenom系统4995 例病人样本和4972例对照样本进行了验证，发现该变异与多种肿瘤的发生相关。Wei Zhenget al. Nature Genetics 2009, 42(2), 324 - 328美国范德比特药学院和上海肿瘤研究所的研究者通过对中国妇女GWASF究以发现乳腺癌相关变异。通过1505例病人和对照样本的分析获得 29个候选SNP§经sequenom iplex系统在1554例病人和1576对照进行验证。后经3472例病例和900对照对四个位点进行进一步研究。发现位于ESR1基因上游的6q25.1上SN

20、P rs2046210位点同乳腺癌相关联。几年来，采用GWA序口各种SNP验证方法发现了各种肿瘤的易感 SN暇点。这些位点是否具有广泛的代表 性，是否能够为肿瘤的预防、治疗和个体化治疗所用，对SNP佥测的方法学要求十分严格，即要求检测的准确性和灵敏度，又要去检测的高通量且价格合适。Sequenom系统是一个十分合适的系统，通量高，准确度和灵敏度好，且单位检测价格低廉。非常适合临床应用。100芸匚三myBornm(n H 23) syGoma (n n 104) LymphomaSH 7)poythn>3a MmrasM 4)Medll_5bfirsioma (n H 10) G-o,ma

21、 (n VCP9)Mmln2ne=om加(二 n 36) pros苗范 W M 951Goowcra 二3H 12)LeukemE s H 45)P 国 ncreacn(n H 3) ovar-snSH 1g)Enddomes竺SHSJLurlgsn 255)Rmnm一 (n H B3)Mm-mnoma 0 1 136)BrBwwbH 60)28trIJLsActLSLmHLLM理a工 六 Qxvr % S4Hx4OCWCLmooBtrw(求)工ouaJnbBi2、各种重要疾病目前，糖尿病、心脏病、帕金森、银屑病等各种流行性和重点疾病都证明有SN陛异有关联。Xue-Jun Zhang et a

22、l. NATURE GENETICS 2009, 42 (2) : 205-210安徽医科大学张学军教授领导的实验室研究了银屑病和SNP的关联性。GWA野析发现了 9个位点的显著差异，利用sequenom massarray系统在5182例病人和6516对照的研究发现了三个差异显著的 SNP位 点，其中两个位点为已有报道位点，位于 LCE基因簇上的rs4085613位点为新发现的位点。Robert Sladek et al. Nature 2007, 445, 881-885加拿大的Constantin Polychronakos实验室采用GWA野析发现了四个位点与二型糖尿病相关，并经sequ

23、enom系统进行验证。Minerva M Carrasquilloet al. Nature Genetics 2008, 41(2), 192 - 198美国Steven G Younkin 团队通过分析844例晚期AD病例和1255例的WGASF究获得了 25个显著相关的位点，利用sequenom iplex 进行了进一步的验证工作，发现在 Xq21.3上的PCDH11沏的SNP (rs5984894)与晚期AD相关3、流行病学和病源微生物检测Sequenom系统和SNP同样在流行病学和病源微生物的分型检测上具有光明的应用前景。目前针对于HPV分型的检测、乙肝耐药性的检测、结核病耐压性的检

24、测研究都在飞速进展。H. YangPNAS 2005, 102:7683-7688HPV已经被证明与宫颈癌、食管癌等肿瘤的发生相关。但由于HPV分型繁多，只有高危型 HPVt有致病风险。因此，HPV的检测不仅是检测HPV的存在与否，更重要的是检测HP份型。利用Sequenom系统，D.M. Kurnita 实验室实现了在人血清中进行 HPV分型，灵敏度由于 RT-qPCR且特异性得到保证。后续的研究不仅实现了 HPV的分型检测，且可以一次反应进行20中HPV型。研究者可以把所有已报道的高危型HPV都包括进来。一次反应，多种分型检测。M Jallow et al. Nature Genetics 41,657 - 665 (2009)疟疾一致肆虐非洲，来自冈比亚和牛津大学实验室对2500儿童进行了 SGW给析，验证研究利用了 3400例儿童，研究发现疟疾的易感性可能同SNP相关联。4、法医学研究和应用SNP在个体识别、人种识别以及外形推断方面具有巨大潜力。在法医学领域 ，SNP也越来越受到大家的重 视。第一，SNP大都表现为二等位基因标记，即人群中只有二个等位基因，易于分型和确定基因频率，适 于混合样品的分析。第二，突变率非常低，在父权鉴定中非常有利。第三，适合