第四章食品微生物学检验

1、第四章第四章 食品微生物学检验食品微生物学检验 食品安全（卫生）标准 食品安全法第18条制定食品安全标准，应当以保障公众身体健康为宗旨以保障公众身体健康为宗旨，做到科学合理、安全可靠 食品安全标准是唯一强制性的标准唯一强制性的标准 食品安全标准由国务院卫生行政部门负责制定公布食品安全标准的内容（一）食品中的致病性微生物致病性微生物、农（兽）药残留、重金属、污染物质以及其他危害人体健康物质的限量规定限量规定；（二）食品添加剂的品种、使用范围、用量；（三）专供婴幼儿的主辅食品的营养成分要求；（四）对与食品安全、营养有关的标签、标识、说明书的要求；（五）食品生产经营过程的卫生要求；（六）与食品安全有

2、关的质量要求；（七）食品检验方法与规程食品检验方法与规程；（八）其他需要制定为食品安全标准的内容；食品安全标准的主要技术指标食品安全标准的主要技术指标1.感官指标感官指标2.理化指标理化指标3.微生物指标微生物指标 (1)菌落总数菌落总数 (2)大肠菌群大肠菌群 (3)霉菌和酵母霉菌和酵母 (4)致病菌致病菌 (5)益生菌（乳酸菌、双歧杆菌）益生菌（乳酸菌、双歧杆菌） (6)抗生素残留、商业无菌抗生素残留、商业无菌如膨化食品中微生物学指标项 目 指标菌落总数菌落总数/（CFU/g） 100大肠菌群大肠菌群/（MPN/100g）90致病菌致病菌 沙门氏菌沙门氏菌 志贺氏菌志贺氏菌 金黄色葡萄球菌

3、金黄色葡萄球菌 不得检出食品安全检验方法与规程食品安全检验方法与规程 在食品安全标准中所规定的每个项目，为在食品安全标准中所规定的每个项目，为保证检验结果对评价食品卫生质量有可比保证检验结果对评价食品卫生质量有可比性、准确性、统一性和权威性，使之具有性、准确性、统一性和权威性，使之具有科学的评价意义，都必须规定科学的评价意义，都必须规定统一的检验统一的检验方法和条件方法和条件。 理化检验（理化检验（GB/T 5009） 微生物检验（微生物检验（GB/T 4789） 放射性物质检验（放射性物质检验（GB/T l4883） 食品安全性毒理学评价程序（食品安全性毒理学评价程序（GB/T l5193）

4、为什么要进行食品微生物学检验 食品安全食品安全问题是关系到人民健康、国家经人民健康、国家经济济（特别是工业、贸易和农业）的可持续可持续发展发展和社会稳定社会稳定的重要问题，是世界关注的热点问题 食品微生物污染问题突出，细菌性、真菌细菌性、真菌性食物中毒占各种食物中毒之首性食物中毒占各种食物中毒之首，每年的发生数量、受害人数、死亡人数和造成的经济损失都是非常巨大的，我国如此，先进的发达国家同样深受其害为什么要进行食品微生物学检验 食品微生物学检验的广泛应用和不断改进，是制定各级预防、监控和预警系统的重要组成部分，是食品微生物污染的溯源、控制和降低由此引起的一系列重大损失的重要有效手段，对促进人民

5、身体健康、经济可持续发展和社会稳定都很重要，具有较大的经济、社会和卫生意义。 食品微生物检验的范围食品微生物检验的范围 食品不论在产地或加工前后，均可能遭受微生物的污染。污染的机会和原因很多，一般有：食品生产环境的污染，食品原料的污染，食品加工过程的污染等。 根据食品被细菌污染的原因和途径可知，食品微生物检验的范围1、生产环境的检验生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙 壁等。2、原辅料检验原辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等 一切原辅材料。3、食品加工、储藏、销售诸环节的检验食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食 品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。4、食

6、品的检验食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。微生物学检验方法国家标准的演变微生物学检验方法国家标准的演变 建国六十多年来，我国食品安全（卫生）建国六十多年来，我国食品安全（卫生）微生物学检验方法的发展经历了三个阶段。微生物学检验方法的发展经历了三个阶段。方法逐步建立、统一阶段（方法逐步建立、统一阶段（19491976年）年）方法标准化形成阶段（方法标准化形成阶段（19771984年）年） 不断修订和完善阶段（不断修订和完善阶段（1985年至今）年至今）第一节第一节 GB/T 4789.12010 总则总则1 范围范围规定了食品微生物检验基本原则和要求规定了食品微生物检

7、验基本原则和要求 适用于食品微生物学检验适用于食品微生物学检验2 规范性引用文件规范性引用文件3 实验室基本要求（环境、人员、设备、检验用品、培养基实验室基本要求（环境、人员、设备、检验用品、培养基和试剂、菌株）和试剂、菌株）4 样品的采集（原则、方案、方法、标记、储存和运输）样品的采集（原则、方案、方法、标记、储存和运输）5 样品检验（处理、检验方法的选择）样品检验（处理、检验方法的选择）6 生物安全与质量控制生物安全与质量控制7 记录与报告记录与报告8 检验后处理（检毕样品处理、检验后处理（检毕样品处理、不进行复检不进行复检）食品微生物学检验的一般程序食品微生物学检验的一般程序 检验前准备

8、 样品的采集与处理 样品的送检与检验 检验 结果报告食品微生物学检验方法标准的内容 细菌菌落总数、大肠菌群、肠道致病菌落总数、大肠菌群、肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）菌） 霉菌霉菌与酵母菌总数及产毒霉菌的霉菌与酵母菌总数及产毒霉菌的鉴别等等鉴别等等第二节 食品中菌落总数的测定GB4789.22010一、实验目的 1. 掌握菌落（细菌）总数测定程序和要点。 2. 学会对不同样品稀释度确定原则。二、概 述 菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1克或1毫升检样中形成的微生物菌落总数 卫生学意义：判定食品被细菌污染程度；观察细菌在食品

9、中繁殖动态。以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据三、实验步骤 检样 10倍稀释 2-3个连续适宜稀释度， 各以1ml之量加入灭菌培养皿内 每皿内加入适量平板计数琼脂，混匀 361培养48h 菌落计数、 报告图四、思考题四、思考题 为什么平板计数琼脂培养基在使用前要保持温度在45 左右？如何保持？ 在进行菌落总数测定时，为什么培养皿倒置培养？培养温度为什么选择36 ？ 根据菌落总数的原始记录报告测定结果。 说明在进行菌落总数测定时应特别注意的问题食品中大肠菌群的测定 GB4789.32010一、实验目的 1. 学习食品中大肠菌群的测定方法。 2. 了解大肠菌群检验的卫生学意义二、概 述 概念：

10、在一定培养条件下能发酵乳糖产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 意义：食品被粪便污染的指标菌；食品被致病菌污染的可能 三、（第一法MPN计数法） （1） 检样稀释 （2） 初发酵（LST）试验 - 361培养48h （3） 复发酵（BGLB）验证 - 361培养48h （4） 报告LST肉汤管或BGLB管是否产气？LST肉汤管或BGLB管是否产气？大肠菌群测定大肠菌群测定第二法平板计数法四、思考题初发酵（LST）试验后，产气的管怎么做初发酵（LST）试验后，没有产气的管能否报告为未检出大肠菌群某学生在对糕点中大肠菌群检验时，实验结果的原始记录（采用稀释度为1g，0.1g，0.01g

11、）：发 酵 管 编 号： 1 2 3 4 59初发酵试验： 复发酵试验： 根据上述试验结果，查表，说明大肠菌群的最可能数。食品中沙门氏菌的检验 沙门氏菌沙门氏菌最重要的病原菌属，根据生化特性分为6个亚属。 检查食品中沙门氏菌的卫生学意义检查食品中沙门氏菌的卫生学意义 沙门氏菌可引起人类伤寒、副伤寒和食物中毒-在世界各地的食物中毒中常占首位或第二位沙门氏菌沙门氏菌检验程序检验程序GB4789.4-2010为什么要前增菌为什么要前增菌？前增菌时间不能长前增菌时间不能长？为什么要用为什么要用2种增菌液种增菌液？平板分离为什么用2种选择性鉴别培养基沙门氏菌在BS上的可疑菌落特征在HE培养基上的典型菌落

12、沙门氏菌TSI的特征如何提高沙门氏菌的检出率？ 对样品进行前增菌，使受损的沙门氏菌恢复活力对样品进行前增菌，使受损的沙门氏菌恢复活力 选择性增菌使用两种选择性分离增菌液选择性增菌使用两种选择性分离增菌液，一种是，一种是抑制除沙门氏菌以外其它肠道菌的生长，一种是抑制除沙门氏菌以外其它肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。的生长。 为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基两种以上选择性分离培养基 接接TSI时，应尽可能多挑几个可疑菌落时，应尽可能多挑几个可疑

13、菌落C-BSI-BSC-HEI-HE生化试验 在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量 同时直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、KCN 培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查 血清学鉴定（选择做）将含有已知抗体的诊断血清与待检菌悬液各一滴要玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分得的细菌的鉴定或分型。报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g样品中检出或未检出沙

14、门氏菌食品中志贺氏菌的检验GB4789.5-2003 志贺氏菌检验的卫生学意义卫生学意义 志贺氏菌检验的基本步骤基本步骤： 增菌、平板分离、生化试验、血清学分型 增菌增菌在对食品中志贺氏菌检验时，为在对食品中志贺氏菌检验时，为什么要用志贺氏菌增菌肉汤什么要用志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素增菌新生霉素增菌并在厌氧环境并在厌氧环境41.5进行培养？进行培养？平板分离 在对增菌液中可能存在的志贺氏菌进行分离时，为什么要用选择性强和选择性弱的琼脂平板各一个？志贺氏菌在这些培养基上呈现什么样的菌落特征？为什么？ 志贺氏菌的菌落典型特征图志贺氏菌的菌落典型特征图福氏志贺氏菌形态图鲍氏志贺氏菌形态图志贺氏菌的T

15、SI试验可疑志贺氏菌可疑志贺氏菌非志贺氏菌非志贺氏菌如何利用实验判定细菌是否具有动力动力阴性（无动力阴性（无鞭毛）的细菌鞭毛）的细菌沿着接种线生沿着接种线生长，因此生长长，因此生长线清晰线清晰动力阳性（有动力阳性（有鞭毛）的细菌鞭毛）的细菌可扩散生长，可扩散生长，因此生长线模因此生长线模糊，呈羽毛状糊，呈羽毛状半固体培养半固体培养基、穿刺、基、穿刺、培养、观察培养、观察血清学试验 颗粒性抗原（细菌等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。食品中金黄色葡萄球菌的检验GB/T4789.10 致病性金黄色葡萄球菌定性检验的原理（

16、3个） 为什么要用7.5%氯化钠肉汤溶液增菌 制备Baird-Parker平板或血平板的过程中注意的问题金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征 在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？为什么？ 鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标有哪些？为什么？ 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验 预防金黄色葡萄球菌食物中毒的发生食品中霉菌和酵母菌检验 食品中霉菌学检验的卫生学意义 对食品中霉菌学检验时应注意的问题 在培养后的平板上出现的粘稠状的菌落，如何确定它是酵母菌而不是细菌 根据原始记录报告检测结果 霉菌菌落GB/T 4789.352008食品中乳酸菌检验乳酸菌乳酸菌一群

17、通过发酵糖类产生大量乳酸一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌通称。的细菌通称。 乳杆菌属乳杆菌属 双歧杆菌属双歧杆菌属 链球菌属的嗜热链球菌链球菌属的嗜热链球菌检验程序检验程序 样品样品25 g（mL）+225 mL 灭菌生理盐水，灭菌生理盐水，10倍系列稀释。倍系列稀释。 选择选择23个适当稀释度各以个适当稀释度各以0.1 mL加入到加入到MRS和和/或或MC琼脂平板进行表面涂布。琼脂平板进行表面涂布。 根据样品中所含菌种选择培养基及培养条根据样品中所含菌种选择培养基及培养条件，见表件，见表1。表表1 乳酸菌计数条件选择乳酸菌计数条件选择 样品种所含菌属样品种所含菌属MRS平板平板36 1 ，

18、48 hMC琼脂平板琼脂平板 36 1 ，48 h厌氧厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧只含乳杆菌属只含乳杆菌属只含双歧杆菌属只含双歧杆菌属同时含乳杆菌属同时含乳杆菌属和双歧杆菌属和双歧杆菌属只含嗜热链球菌只含嗜热链球菌同时含乳杆菌属、双歧同时含乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌杆菌属和嗜热链球菌注:+表示使用此培养基及培养条件；表示不使用此培养基及培养条件。报告报告 根据菌落计数结果出具检测报告。最终确根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定的乳酸菌菌落在定的乳酸菌菌落在303 300之间的平板计数，之间的平板计数，再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效数字，之后的数字，采用效数字，之后的数字，采用1010的指数表示。的指数表示。参照参照GB/T 4789.2GB/T 4789.2规定。每克（或毫升）食规定。每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌数以品中所含有的乳酸菌数以CFU/g（mL）表）表示。示。StreptococcusStreptococcus and Lactobacillus乳酸菌的鉴定乳酸菌的鉴定 纯培养纯培养 挑取挑取3个或以上的可疑菌落，嗜热链球菌接个或以上的可疑菌落，嗜热链球