酶联免疫吸附试验ELISAELISA夹心法测定抗原ELISA间接法测定

1、会计学1酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISAELISA夹心法测夹心法测定抗原定抗原ELISA间接法测定间接法测定原理及意义原理及意义 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免疫检对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免疫检测技术。测技术。 将已知抗原或抗体吸附在固相载体微

2、孔聚苯乙烯塑料板上，通将已知抗原或抗体吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上，通过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加酶标过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加酶标抗体（酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原免疫反应的抗体（酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原免疫反应的特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应酶底物的作特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应酶底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含

3、量。 常用的常用的ELISAELISA法有法有双抗体夹心法测定抗原和间接法测定抗体。双抗体夹心法测定抗原和间接法测定抗体。ELISAELISA法双抗体夹心法测定抗原法双抗体夹心法测定抗原1.1.原理原理一步法一步法二步法二步法常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法一步法 将图中的第将图中的第2 2步和第步和第3 3步同时进行，允许混合加入，其形步同时进行，允许混合加入，其形成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果。二步法二步法 如图中第如图中第2 2步和第步和第3 3步由

4、于分步进行，其结果较准确，主步由于分步进行，其结果较准确，主要用于需要定量检测时。要用于需要定量检测时。2.2.材料（以测材料（以测HBsAgHBsAg为例）为例）试剂：试剂：HBsAgHBsAg诊断试剂盒诊断试剂盒器材：酶联仪，微量加样器，吸头等器材：酶联仪，微量加样器，吸头等3.3.方法方法加样：每组加样：每组7 7微孔，待检微孔，待检4 4孔，空白对照孔，空白对照1 1孔，阴、阳性对照各孔，阴、阳性对照各1 1孔。分别加阴、阳性对照孔。分别加阴、阳性对照1 1滴和滴和50ul50ul待测样本于相应孔内，置待测样本于相应孔内，置3737水浴箱温育水浴箱温育3030分钟。分钟。加酶：除空白对

5、照孔外，每孔加加酶：除空白对照孔外，每孔加1 1滴酶标溶液，混匀后封板，滴酶标溶液，混匀后封板，置置3737水浴箱温育水浴箱温育3030分钟。分钟。洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置2020秒，甩去洗秒，甩去洗涤液，重复涤液，重复4 4次，最后一次在吸水纸上拍干。次，最后一次在吸水纸上拍干。显色：每孔加底物液显色：每孔加底物液A A 、B B 各各1 1滴（滴（50ul50ul），轻拍混匀，置），轻拍混匀，置3737水浴水浴1515分钟，肉眼观察。分钟，肉眼观察。终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液1 1滴（滴（50ul50ul），轻拍混匀。）

6、，轻拍混匀。4.4.结果测定结果测定 用酶标仪（用酶标仪（450nm450nm）测定各孔吸光度）测定各孔吸光度ODOD值（先用空白孔校零），值（先用空白孔校零），P/NP/N值值2.12.1者判为者判为HBsAgHBsAg阳性，阳性，2.12.1者判为阴性。者判为阴性。ELISAELISA法法间接法测定抗体间接法测定抗体1.1.原理原理2.2.材料（以测结核抗体为例）材料（以测结核抗体为例）试剂：结核抗体诊断试剂盒试剂：结核抗体诊断试剂盒器材：酶联仪，微量加样器，吸头等器材：酶联仪，微量加样器，吸头等3.3.方法方法包被抗原：在聚苯乙烯微量反应板孔中加抗原包被抗原：在聚苯乙烯微量反应板孔中加抗

7、原100100ll，4 124 121818小时。小时。用用1 1BSABSA或正常兔血清或正常兔血清44、12121818小时阻断，小时阻断，44冰箱备用冰箱备用。洗涤：用前应进行漂洗去除杂蛋白，用洗涤液洗洗涤：用前应进行漂洗去除杂蛋白，用洗涤液洗3 3次，每次次，每次3 3分钟。分钟。加待测样本：将血清稀释成加待测样本：将血清稀释成1 1：5050，每份标本加复孔，每孔，每份标本加复孔，每孔100100ll，3737保温保温3030分钟。设已知的阳性和阴性血清对照。分钟。设已知的阳性和阴性血清对照。洗涤洗涤3 3次后，加兔抗次后，加兔抗IgGIgG酶结合物，酶结合物，3737保温保温303

8、0分钟，以相同分钟，以相同的方法洗涤的方法洗涤3 3次。次。加新鲜配制的邻苯二胺底物溶液和双氧水溶液各加新鲜配制的邻苯二胺底物溶液和双氧水溶液各100100ll。静静止止2020分分钟钟，再加入，再加入3mol/L3mol/L硫酸每孔硫酸每孔50l50l终终止反止反应应。4.4.结果测定结果测定肉眼观察：白色背景上观察四孔呈现的颜色反应，与已知阳性肉眼观察：白色背景上观察四孔呈现的颜色反应，与已知阳性和阴性孔比较。和阴性孔比较。酶联仪比色：酶联仪用酶联仪比色：酶联仪用492nm492nm测测ODOD值。正常人血清值。正常人血清ODOD0.390.39，结核患者结核患者0.40.4。正常人存在着

9、结核抗体，一般为。正常人存在着结核抗体，一般为0.20.20.390.39。儿童卡介苗接种和隐性结核菌感染时可儿童卡介苗接种和隐性结核菌感染时可0.40.4，但患结核病结核，但患结核病结核抗体抗体ODOD值值0.60.6，为轻度升高。，为轻度升高。常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法一步法 将图中的第将图中的第2 2步和第步和第3 3步同时进行，允许混合加入，其形步同时进行，允许混合加入，其形成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果。二步法二步法 如图中第如图中第2 2

10、步和第步和第3 3步由于分步进行，其结果较准确，主步由于分步进行，其结果较准确，主要用于需要定量检测时。要用于需要定量检测时。3.3.方法方法加样：每组加样：每组7 7微孔，待检微孔，待检4 4孔，空白对照孔，空白对照1 1孔，阴、阳性对照各孔，阴、阳性对照各1 1孔。分别加阴、阳性对照孔。分别加阴、阳性对照1 1滴和滴和50ul50ul待测样本于相应孔内，置待测样本于相应孔内，置3737水浴箱温育水浴箱温育3030分钟。分钟。加酶：除空白对照孔外，每孔加加酶：除空白对照孔外，每孔加1 1滴酶标溶液，混匀后封板，滴酶标溶液，混匀后封板，置置3737水浴箱温育水浴箱温育3030分钟。分钟。洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置2020秒，甩去洗秒，甩去洗涤液，重复涤液，重复4 4次，