微生物的实验室培养

1、巴斯德巴斯德失败的原因：发酵物中混入了杂菌失败的原因：发酵物中混入了杂菌法国，微生物学家认识到了：保持培养物纯净的重要认识到了：保持培养物纯净的重要性。性。防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。是研究和应用微生物的前提。课题1 微生物的实验室培养1.需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件2.需要确保无处不在的其他微生物无法混入即防止杂菌污染特点：特点：小小; ; 简简单单; ; 低低等等; ; 代代谢速度快。谢速度快。一、微生物：一、微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称微生物微生物无

2、细胞结构：无细胞结构：病毒病毒有细胞有细胞结构结构原核生物原核生物: :细菌、蓝藻细菌、蓝藻原生原生生物：生物：真真核核生物生物: :单单细胞的动植物细胞的动植物真菌真菌: :如酵母菌如酵母菌如草履虫、单细胞如草履虫、单细胞藻类等藻类等二、培养基二、培养基1、概念、概念：人们按照微生物对人们按照微生物对营养物质营养物质的的不同需求，配置供出其不同需求，配置供出其生长繁殖生长繁殖的营养基质。的营养基质。2、种类、种类（1 1）按）按物理状态物理状态分分：液体液体培养基培养基固体固体体培养基体培养基半固体半固体体培养基体培养基（不加凝固剂凝固剂琼脂（加较多较多凝固剂 琼脂（加较少较少凝固剂琼脂、用

3、于工业生产工业生产）、用于分离、鉴定、分离、鉴定、计数、保藏计数、保藏等）、用于观察运运动动等）琼脂：一种从红藻中提取的琼脂：一种从红藻中提取的多糖多糖，在，在98 以上熔化，在以上熔化，在44 以下凝固，在常规培养以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。条件下呈现固态。单个单个或或少数少数菌体菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度大小、形状、光泽度、颜颜色、透明度等。色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：菌落菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体根霉根霉 曲霉曲霉 青霉青霉(2）化学成分）化学成分天然天然培养基培养

4、基合成合成培养基培养基：含化学含化学成分不明确成分不明确的的天然物质天然物质：培养基培养基成分明确成分明确(用化学用化学成分已知的化学物质配成成分已知的化学物质配成)、用于、用于工业生产工业生产用于分用于分类、鉴定类、鉴定(3）用途）用途选选择择培养基培养基鉴别鉴别培养基培养基：添加或缺少某种化学成分添加或缺少某种化学成分, , 从从众多微生物中分离出所需微生物众多微生物中分离出所需微生物：加加入某种指示剂或化学药品入某种指示剂或化学药品, ,用以用以鉴别鉴别不同种类的微生物不同种类的微生物选择选择培养基培养基加入加入高浓度食盐高浓度食盐的的培养基培养基分离分离金黄色葡金黄色葡萄球菌萄球菌鉴别

5、鉴别培养基培养基伊红美蓝伊红美蓝培养基培养基鉴别鉴别饮用水或乳制品中饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌是否有大肠杆菌(若有，若有，菌落呈现菌落呈现深紫色深紫色，并带，并带有金属光泽有金属光泽)3.3.基本成分：基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳碳源：源：无机无机碳源：碳源：有机有机碳源：碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -自养自养微生物微生物异养异养微生物微生物提供提供碳元素碳元素的物质的物质1.不能作为异养微生物碳源的是（不能作为异养微生物碳源的是（ ） A牛肉膏牛肉膏B含碳有机物含碳有机物 C石油石油D含碳无机物含碳无机物氮氮源：源

6、：无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：N N2 2 、NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含C C、H H、O O、N N的有机物的有机物是是异养型异养型微生物微生物的的碳源碳源、氮源氮源、能源能源提供提供氮元素氮元素的物质的物质（ N N2 2: :固氮菌）固氮菌）注意：注意：满满足微生物足微生物对对pH、特殊营养物质、特殊营养物质、氧气的要求氧气的要求特特殊营殊营养养( (生长因子）生长因子）：维生维生素、氨基酸、碱素、氨基酸、碱基等基等pHpH、氧气的需求：、氧气的需求：霉菌霉菌（pHpH调至酸性）调至酸性）细菌细

7、菌（pHpH调至中性或微碱性）调至中性或微碱性）厌氧生厌氧生物（物（需需提供无氧条提供无氧条件件）原因：原因： 它们缺乏合成这些物质所需要的酶或它们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限合成能力有限成分成分:水、无机盐、碳源、氮水、无机盐、碳源、氮源（基本成分）源（基本成分）+满足微生物对满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的要求、特殊营养物质、氧气的要求思考：为什么大多数培养基都含有这思考：为什么大多数培养基都含有这四类物质？四类物质？ 构成细胞的基本元素有构成细胞的基本元素有C、H、N、O，所以培养基应该有提供，所以培养基应该有提供C的物质的物质（碳源）、提供（碳源）、提供N源的物质（氮

8、源）、源的物质（氮源）、提供提供H、O的物质（的物质（H2O） 组成细胞的大量元素中，除了组成细胞的大量元素中，除了C、H、N、O外，外，还有还有P、S、K、Ca、Mg等等，所以培养基中应该还含有提供，所以培养基中应该还含有提供P、S、K、Ca、Mg的物质（无机盐）的物质（无机盐）二二. .无菌技术：无菌技术：1. 概念概念：泛指培养微生物操作中，所有：泛指培养微生物操作中，所有防防 止杂菌污染止杂菌污染的方法。的方法。2. 目的：目的：防防止外来杂菌的污染止外来杂菌的污染有有效避免效避免操作者自身被微生物感操作者自身被微生物感染染3 3. .无菌范围：无菌范围：实实验操作空验操作空间间、操作

9、者的手、衣着操作者的手、衣着进行清洁和进行清洁和消毒消毒用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌灭菌为避免周围环境中微生物的污染，为避免周围环境中微生物的污染，实验操作过程实验操作过程应在应在酒酒精灯火焰附近精灯火焰附近进行进行避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触消毒：消毒：煮沸消毒法：煮沸消毒法：使用较为使用较为温和温和的物理或化学方法杀死的物理或化学方法杀死物体表面或内部的物体表面或内部的部分微生物部分微生物（不包不包括芽孢和孢子括芽孢和孢子）100100煮沸煮沸5-6min5-6min巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 70-7

10、5 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min不耐高温不耐高温的的液体液体 如牛奶如牛奶化化学药剂学药剂用用75%75%酒精酒精擦拭双手擦拭双手 氯气氯气消毒水源消毒水源紫紫外外线线消毒消毒接种室接种室、接种箱接种箱或或超净工作台超净工作台在使用前，可以在使用前，可以用紫外线照射用紫外线照射30min，可以杀死物体，可以杀死物体表面或空气表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚酚皂溶液等消毒，可以加强消毒效果。溶液等消毒，可以加强消毒效果。灭菌：灭菌：灼烧灭菌灼烧灭菌：使用使用强烈强烈的理化因素杀死物体内外的理

11、化因素杀死物体内外所有所有的微生物（的微生物（包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子）干热灭菌干热灭菌：高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌：对象：对象：接种坏、接种针或其他金接种坏、接种针或其他金属工具属工具方法：方法：在酒精灯火焰的在酒精灯火焰的充分燃烧层充分燃烧层灼烧灼烧、试管口或瓶口、试管口或瓶口160 160 -170 -170 下加热下加热1-2h1-2h。方法：方法：对象：对象：耐高温耐高温、需保持干燥需保持干燥的的 物品物品如玻璃器皿（吸管、培养皿）、金属用具如玻璃器皿（吸管、培养皿）、金属用具100KPa、121、1530min培养基培养基方法：方法：对象：对象：比较比较项项理化因素的作理化因素的

12、作用强度用强度消灭微生物的消灭微生物的数量数量芽孢和孢子能芽孢和孢子能否被消灭否被消灭消消毒毒灭灭菌菌消毒与灭菌的比较消毒与灭菌的比较较为温和较为温和强烈强烈部分部分生活状生活状态的微生物态的微生物全部全部微生物微生物不能不能能能原理相同：原理相同：都使微生物的蛋白质变性，借都使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物此杀死微生物有些细菌在一定的条件下，有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形细胞里面形成一个椭圆形的的休眠体休眠体，叫做芽孢。芽，叫做芽孢。芽孢的孢的壁很厚壁很厚，对干旱、低，对干旱、低温、高温等温、高温等恶劣的环境有恶劣的环境有很强的抵抗力很强的抵抗力。例如，有。例如，有的细菌

13、的芽孢，煮沸的细菌的芽孢，煮沸3 3小小时以后才死亡。芽孢又时以后才死亡。芽孢又小小又又轻轻，可以随风飘散。当，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌以萌发，形成一个细菌抗逆性休眠体抗逆性休眠体细菌、原生动物、真细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一菌和植物等产生的一种有繁殖作用的种有繁殖作用的生殖生殖细胞细胞。能直接发育成。能直接发育成新个体。新个体。 生殖细胞生殖细胞p16请你判断以下材料或用具是请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。择合适的方

14、法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿。培养细菌用的培养基与培养皿。(2)玻璃试管、烧瓶和吸管。玻璃试管、烧瓶和吸管。(3)实验操作者的双手。实验操作者的双手。培养基：培养基：高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养皿、培养皿、(2)玻璃试管、烧瓶和吸管：玻璃试管、烧瓶和吸管： 干热灭菌干热灭菌(3)：化学消毒化学消毒制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g依依配方配方计算各成分的用量

15、计算各成分的用量2.2.称量：称量：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖3.3.溶化：溶化：牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：培养培养基基: :高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌6.6.倒平板：倒平板：把把锥形瓶锥形瓶内的培养基内的培养基倒入倒入培养皿培养皿三、实验操作三、实验操作培培养养皿皿: :干热灭菌干热灭菌溶化时为什么要将牛肉膏牛肉膏连同连同称量纸称量纸一起加热

16、?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中，减少误差减少误差。在灭菌前，用用牛皮纸、旧报纸包紧牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞浸湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中隔绝空气中杂菌污染的作用杂菌污染的作用。约约50待冷却后，将待冷却后，将平板倒置平板倒置：瓶口瓶口迅速通过火焰迅速通过火焰不能完不能完全打开全打开酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近皿盖在下，皿底在上皿盖在下，皿底在上倒平板操作讨论题倒平板操作讨论题1培培养基灭菌后，需要养基灭菌后，需要冷却到冷却到50 左右左右时，时，才能用来倒平板。你用才能用来倒平板。你用什么办法什么办法来估计

17、培养基的来估计培养基的温度？温度？答案：答案：可以可以用手触摸用手触摸盛有培养基的锥盛有培养基的锥形瓶，形瓶，感觉感觉锥形瓶的温度下降到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫刚刚不烫手手时，就可以进行倒平板了。时，就可以进行倒平板了。2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答案：答案：通通过灼烧灭菌，过灼烧灭菌，防止瓶口的防止瓶口的微生物污染培养基微生物污染培养基。3平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答案：答案：平平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平

18、板倒置，既板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地可以使培养基表面的水分更好地挥发挥发，又可以，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染造成污染。答案：答案：不能。不能。4在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在基溅在皿盖皿盖与与皿底皿底之间的部位，这个平板还能之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？用来培养微生物吗？为什么？空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内的培养基，并污染皿内的培养基，所以，最好不要用所以，最好不要用这种平板培养微生物。这种平板培养微生物。纯化纯化大肠杆菌

19、：大肠杆菌：2 2. .接接种种方法：方法：平板划线法：平板划线法：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：(3)(3)斜面接种斜面接种（4)4)穿刺接种穿刺接种1、概念：、概念： 获得获得纯净纯净的大肠杆菌的大肠杆菌平平板划线法：板划线法：原理：原理：通过通过接种环接种环在琼脂固体培养在琼脂固体培养基表面基表面连续划线连续划线的操作的操作，将，将聚集聚集的的菌种菌种逐步稀释逐步稀释分散到培养基表面分散到培养基表面 。在在数次划线数次划线后培养，可以分离到由后培养，可以分离到由一个细胞一个细胞繁殖而来的肉眼可见的繁殖而来的肉眼可见的子子细胞群体，即菌落细胞群体，即菌落。 一一旦旦划破，会造成划线不均匀

20、，划破，会造成划线不均匀，难以达难以达到分离单菌落的目的到分离单菌落的目的；且无法形成规矩且无法形成规矩的菌落的菌落。划线后划线后 培养一段时间后培养一段时间后讨论：讨论：(1)平板划线各次灼烧接种环的目的。平板划线各次灼烧接种环的目的。第一次灼烧第一次灼烧：每次划线之每次划线之前灼烧前灼烧：避免接种环上可能存在的微生避免接种环上可能存在的微生物污染培养物物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每残留的菌种，使每 次划线的菌次划线的菌种来自上次划线末端种来自上次划线末端划线结束划线结束：杀死接种环上残留的菌种，避杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感

21、染操作者免细菌污染环境和感染操作者2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后冷却后再进行划线再进行划线？3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的总是从上一次划线的末端开始划线末端开始划线？答：答：以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。答：答：划线后，线条划线后，线条末端末端细菌的数目比线条细菌的数目比线条起始起始处要少，每次从上一次划线的末端开处要少，每次从上一次划线的末端开始，始，能使细菌的数目随着划线次数的增加能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁

22、殖而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落而来的菌落。31稀释涂布平板接种原理：将原理：将菌液菌液进行一系列梯度进行一系列梯度稀稀释释，然后将不同稀释度菌液分别，然后将不同稀释度菌液分别涂布到涂布到琼脂琼脂固体培养基固体培养基上进行培上进行培养。当稀释倍数足够高时，聚集养。当稀释倍数足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成在一起的微生物将被分散成单个单个细胞细胞，从而在培养基表面形成单，从而在培养基表面形成单个菌落。个菌落。涂布器涂布器系系列稀释操作列稀释操作101102103104105106 (1)(1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管水的试管灭菌灭菌并编号。并编号。 (2)(

23、2)用用移液管移液管吸取吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，管中，轻压橡皮头，吹吸三次吹吸三次使之充分混匀。使之充分混匀。 (3)(3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第稀释液，注入第三支试管中，重复步骤三支试管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。移液管需要经过移液管需要经过灭菌灭菌，操作时，操作时，试管口和移液管试管口和移液管应在离火焰应在离火焰12cm处。处。涂布平板操作将将涂布器涂布器浸在盛有浸在盛有酒精酒精的烧的烧杯中杯中 取少量稀取少量稀释释液（液（不不超过超过0.1ml

24、0.1ml) )滴滴加到培养加到培养基表面基表面 将沾有少量酒精的将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引涂布器在火焰上引燃燃灼灼烧。烧。待酒精燃待酒精燃尽后，尽后，冷冷却却8 810s 10s 用涂布器将菌液均匀用涂布器将菌液均匀地地涂布涂布在培养基表面。在培养基表面。涂布时可转动培养皿，涂布时可转动培养皿，使涂布均匀使涂布均匀涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第无菌操作要求，想一想，第2 2步应如何步应如何进行无菌操作？进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无无菌

25、菌”。例如，酒精灯与培养皿的距。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。等等。3平板划线法和稀释涂布平板法的比较平板划线法和稀释涂布平板法的比较优点缺点适用范围平板划线平板划线分离法分离法稀释涂布稀释涂布平板法平板法可以观察菌落可以观察菌落特征，对特征，对混合混合菌进行分离菌进行分离可以观察菌可以观察菌落特征、落特征、可可以计数以计数不能计数不能计数吸收量较少、吸收量较少、较麻烦，平板较麻烦，平板不干燥效果不不干燥效果不好，容易蔓延好，容易蔓延适用于好氧菌适用于好氧菌适用于适用于厌氧厌

26、氧菌和兼性厌菌和兼性厌氧菌氧菌平板划线法：用于平板划线法：用于分离分离混合菌，适用于混合菌，适用于好氧菌好氧菌稀释涂布平板法：用于稀释涂布平板法：用于计数计数，适用于，适用于厌氧厌氧菌菌和兼性厌氧菌和兼性厌氧菌( (三三) )菌种培养：菌种培养：将将接种的接种的培养基培养基（至少（至少3 3个）个）和和一个未接一个未接种的种的培养基倒培养基倒置，放置，放入入3737的的恒温箱恒温箱中，中，培养培养1212天后。天后。( (四四) ) 观察、记录结果观察、记录结果: :未接种的培养基未接种的培养基表面表面是否有菌是否有菌落落生长生长 接种的培养基长的菌落的接种的培养基长的菌落的形态形态、大小大小、颜色颜色四、课题成果评价四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格如果如果未接种的培养基未接种的培养基在恒温箱中保温在恒温箱中保温1 12 d2 d后后无菌落生长无菌落生长，说明，说明培养