基础生物化学酶课件

1、基础生物化学酶12基础生物化学酶3基础生物化学酶The Nobel Prize in Chemistry 19074基础生物化学酶The Nobel Prize in Chemistry 1946 Sumner Stanley Northropfor their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form for his discovery that enzymes can be crystallized 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize5基础生物化学酶6基

2、础生物化学酶7基础生物化学酶8基础生物化学酶9基础生物化学酶10基础生物化学酶11基础生物化学酶12基础生物化学酶13基础生物化学酶14基础生物化学酶15基础生物化学酶L(+)乳酸通过其不对称乳酸通过其不对称C原子上的原子上的CH3、COOH及及OH基分别与乳酸脱氢酶活性中心的基分别与乳酸脱氢酶活性中心的A、B及及C三个三个功能基团结合，故可受酶催化而转变为丙酮酸。功能基团结合，故可受酶催化而转变为丙酮酸。D(-)乳酸由于乳酸由于OH、COOH的空间位置与的空间位置与L(+)乳酸相乳酸相反，与酶的三个结合基团不能完全配合，故不能与反，与酶的三个结合基团不能完全配合，故不能与酶结合受其催化。酶结

3、合受其催化。16基础生物化学酶17基础生物化学酶18基础生物化学酶19基础生物化学酶20基础生物化学酶21基础生物化学酶22基础生物化学酶23基础生物化学酶小分子有机化合物在催化中的作用小分子有机化合物在催化中的作用尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸维维生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（维维生生素素B6之之一一）叶叶酸酸NAD+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，辅辅酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌

4、嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，辅辅酶酶II）FMN （黄黄素素单单核核苷苷酸酸）FAD（黄黄素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）辅辅酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸钴钴胺胺素素辅辅酶酶类类生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氢氢叶叶酸酸氢氢原原子子（质质子子）醛醛基基酰酰基基烷烷基基二二氧氧化化碳碳氨氨基基甲甲基基、甲甲烯烯基基、甲甲炔炔基基、甲甲酰酰基基等等一一碳碳单单位位所所含含的的维维生生素素名名称称小小分分子子有有机机化化合合物物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)转转移移的的基基团团尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素P

5、P之之一一）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸维维生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（维维生生素素B6之之一一）叶叶酸酸NAD+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，辅辅酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，辅辅酶酶II）FMN （黄黄素素单单核核苷苷酸酸）FAD（黄黄素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）辅辅酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸钴钴胺胺素素辅辅酶酶类类生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氢氢叶叶酸酸氢氢原原子子（质质子子）醛

6、醛基基酰酰基基烷烷基基二二氧氧化化碳碳氨氨基基甲甲基基、甲甲烯烯基基、甲甲炔炔基基、甲甲酰酰基基等等一一碳碳单单位位所所含含的的维维生生素素名名称称小小分分子子有有机机化化合合物物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)转转移移的的基基团团24基础生物化学酶25基础生物化学酶26基础生物化学酶27基础生物化学酶28基础生物化学酶29基础生物化学酶30基础生物化学酶 根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员会，将酶分为六大类：会，将酶分为六大类：31基础生物化学酶32基础生物化学酶33基础生物化学酶34基础生物化学酶35基础生物化学酶36基础生物化学酶乳酸脱氢酶乳

7、酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号37基础生物化学酶38基础生物化学酶39基础生物化学酶1. 酶的催化作用及分子活化能酶的催化作用及分子活化能40基础生物化学酶基础生物化学酶41Enzyme Stabilizes Transition State SPESESTEPSTReaction directionEnergy changeEnergy required (no catalysis)Energy decreases

8、 (under catalysis)Whats the difference?T = Transition state42基础生物化学酶2. 中间产物学说中间产物学说ES+P+In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.SEE43基础生物化学酶44基础生物化学酶3. 酶的活性部位和必需集团酶的活性部位和必需集团45基础生物化学酶4

9、6基础生物化学酶47基础生物化学酶4. 酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）4.1 锁钥假说锁钥假说(lock and key hypothesis)：48基础生物化学酶4.2诱导契合假说（诱导契合假说（inducedfit hypothesis): 49基础生物化学酶50基础生物化学酶5. 使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素5.1 邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应51基础生物化学酶52基础生物化学酶5.2 “张力张力”和和“变形变形”从而使底物分子某些键的键从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应的活化能，能减弱，产

10、生键扭曲，降低了反应的活化能，有助于过渡态的中间产物形成有助于过渡态的中间产物形成53基础生物化学酶54基础生物化学酶5.3 酸碱催化酸碱催化55基础生物化学酶5.4 共价催化共价催化56基础生物化学酶5.5 酶活性中心是低介电区域酶活性中心是低介电区域57基础生物化学酶58基础生物化学酶6. 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶是一个丝氨胰凝乳蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶，活性中心的酸蛋白酶，活性中心的残基：残基：AspAsp102 102 HisHis57 57 SerSer19519559基础生物化学酶Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mec

11、hanism A1NCCNHOOCHOCCNCCNH2OCheck substrate specificity60基础生物化学酶Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A2NCCNHOOCHOCCNCCNH2OFirst Transition State61基础生物化学酶HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A3NCCNHOOCHOCCNCCNH2OAcyl-Enzyme Intermediate62基础生物化学酶HChymotrypsin Catalytic Mechanism D1N-HCCNH

12、OOCHOCCNCCNH2OHOHAcyl-Enzyme Water Intermediate63基础生物化学酶HChymotrypsin Catalytic Mechanism D2OOCCNCCNH2HSecond Transition StateOH64基础生物化学酶HChymotrypsin Catalytic Mechanism D3OCCNCCNH2OOHDeacylationH65基础生物化学酶66基础生物化学酶67基础生物化学酶7. 酶原激活酶原激活68基础生物化学酶69基础生物化学酶70基础生物化学酶71基础生物化学酶 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影

13、响时，其余各因素均恒定。72基础生物化学酶1. 酶反应速度的测量酶反应速度的测量73基础生物化学酶74基础生物化学酶2. 酶浓度对酶作用的影响酶浓度对酶作用的影响75基础生物化学酶3. 底物浓度对酶作用的影响和米氏方程底物浓度对酶作用的影响和米氏方程3.1 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响基础生物化学酶76 Increase Substrate Concentration 2134567800 2 4 6 8Substrate (mmole)Product806040200S+EP(in a fixed period of time)77基础生物化学酶78基础生物化学酶

14、基础生物化学酶79Constant ES Concentration at Steady StateSPEESReaction TimeConcentrationJuang RH (2004) BCbasics80基础生物化学酶3.2 米氏方程米氏方程81基础生物化学酶Km 米氏常数米氏常数Vmax 最大反应速度最大反应速度82基础生物化学酶米氏方程的推导：米氏方程的推导：83基础生物化学酶84基础生物化学酶85基础生物化学酶86基础生物化学酶K Km mSS KKm m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/Lm

15、ol/L。2 2K Km m + S+ S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV VmaxmaxS S K Km m + S + S 87基础生物化学酶3.3 米氏常数米氏常数Km的意义的意义Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。物浓度。88基础生物化学酶基础生物化学酶89Km = SKm + S = 2 SVmax2=Vmax SKm + SKm: Affinity with Substrate If vo =Vmax2S2S1S3S1 S2 S3Vmax1/2When using different substrateAffin

16、ity changesKmvo =Vmax SKm + S90基础生物化学酶3.4 Km值与值与Vmax值的测定值的测定91基础生物化学酶基础生物化学酶92An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)VmaxKmSvo1/S1voDouble reciprocalDirect plot Use predefined amount of Enzyme E Add substrate in various concentrations S (x 軸) Measure Product in fixed Time (P/t) vo (y 軸) (x, y) pl

17、ot get hyperbolic curve, estimate Vmax When y = 1/2 Vmax calculate x (S) Km1Vmax- 1 Km1/2基础生物化学酶93A Real Example for Enzyme KineticsDatano12340.250.501.02.00.420.720.800.92Absorbancev (mmole/min)S0.210.360.400.46(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction ti

18、me was 10 min VelocitySubstrate ProductDouble reciprocal1/S1/v4210.52.081.561.351.16 1.00.50vDirect plotDouble reciprocal2.01.001/v-4 -2 0 2 41/S0 1 2S1.0-3.8基础生物化学酶94 例1：下列数据是对酶促反应sp的记录： s(molL-1) v(nmolL-1min-1) 6.2510-6 15.0 7.5010-5 56.25 1.0010-4 60 1.0010-3 74.9 1.0010-2 75 1.0010-1 75 求（1）Vma

19、x和Km (2) s=2.510-5和s=2.0010-1时v等于多大。基础生物化学酶95 例2：下列数据是对酶促反应sp的记录： s(umolL-1) v(umolmin-1) 0.1 0.27 10.0 20.0 60.0 80.0 200 120 1000 150 1500 160 2000 160 求（1）Vmax和Km (2) s =1600时游离酶的浓度多大？96基础生物化学酶4. pH对酶作用的影响对酶作用的影响97基础生物化学酶pH影响酶作用的原因：影响酶作用的原因：98基础生物化学酶5. 温度对酶作用的影响温度对酶作用的影响99基础生物化学酶100基础生物化学酶101基础生物

20、化学酶102基础生物化学酶6. 激活剂对酶作用的影响激活剂对酶作用的影响103基础生物化学酶104基础生物化学酶105基础生物化学酶7. 抑制剂对酶作用的影响抑制剂对酶作用的影响106基础生物化学酶107基础生物化学酶108基础生物化学酶7.1 不可逆性抑制作用不可逆性抑制作用109基础生物化学酶110基础生物化学酶7.2 可逆性抑制作用可逆性抑制作用111基础生物化学酶7.2.1 竞争性抑制竞争性抑制112基础生物化学酶113基础生物化学酶114基础生物化学酶115基础生物化学酶116基础生物化学酶117基础生物化学酶118基础生物化学酶119基础生物化学酶7.2.2 非竞争性抑制非竞争性抑

21、制120基础生物化学酶121基础生物化学酶122基础生物化学酶123基础生物化学酶有非竞争性抑制剂存在时，有非竞争性抑制剂存在时，V值减小值减小(1+I/Ki)倍，倍，且且V值随值随I的增高而降低；的增高而降低；Km值不变。值不变。124基础生物化学酶125基础生物化学酶7.2.3 反竞争性抑制反竞争性抑制126基础生物化学酶127基础生物化学酶128基础生物化学酶129基础生物化学酶基础生物化学酶130Enzyme Inhibition (Mechanism)IISSSI II II IIISCompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferent

22、 siteCompete for active siteInhibitorSubstrateCartoon GuideEquation and Description binds to free E only,and competes with S;increasing S overcomesInhibition by . binds to free E or ES complex; Increasing S cannot overcome inhibition. binds to ES complex only, increasing S favorsthe inhibition by .E

23、 + S ES E + P + E E + S ES E + P + + E + S E S E + S ES E + P + E S EISX基础生物化学酶131KmEnzyme Inhibition (Plots)I IIICompetitiveNon-competitiveUncompetitive Direct PlotsDouble ReciprocalVmaxVmaxKmKmS, mMvoS, mMvoKmS, mMVmaxKmVmaxVmaxVmax unchangedKm increasedVmax decreasedKm unchangedBoth Vmax & Km

24、 decreased1/S1/Km1/vo1/ VmaxTwo parallellinesIntersect at X axis1/vo1/ Vmax1/S1/Km1/S1/Km1/ Vmax1/vo Intersect at Y axis= Km132基础生物化学酶133基础生物化学酶134基础生物化学酶135基础生物化学酶136基础生物化学酶137基础生物化学酶138基础生物化学酶基础生物化学酶139TTRTSvoMechanism and Example of Allosteric EffectS SS SRRS SS SRS SAITSvoSvo(+)(-)XXXR = Relax(a

25、ctive)T = Tense(inactive)Allosteric siteHomotropic(+)ConcertedHeterotropic(+)SequentialHeterotropic(-)ConcertedAllosteric siteKineticsCooperationModels(-)(+)(+)Juang RH (2004) BCbasics140基础生物化学酶141基础生物化学酶142基础生物化学酶143基础生物化学酶144基础生物化学酶145基础生物化学酶146基础生物化学酶147基础生物化学酶148基础生物化学酶149基础生物化学酶150基础生物化学酶151基础生

26、物化学酶152基础生物化学酶153基础生物化学酶基础生物化学酶154Turn Over Numbers of EnzymesCatalase H2O2Carbonic anhydrase HCO3-Acetylcholinesterase Acetylcholine40,000,000400,000140,000b-Lactamase Benzylpenicillin2,000Fumarase Fumarate800RecA protein (ATPase) ATP0.4EnzymesSubstratekcat (s-1)The number of product transformed fr

27、om substrate by one enzyme molecule in one second基础生物化学酶155Enzyme Kineticsvo=Vmax SKm + SKm Vmax&E1E2E31st orderzero orderCompetitiveNon-competitiveUncompetitiveDirect plotDouble reciprocalBi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the otherAffinity withsubst