卑霉素的合成途径及分子生物学进展

1、第15卷 第3期 天 津 农 学 院 学 报 V ol.15,No.3 2008年9月 Journal of Tianjin Agricultural University September ,2008*收稿日期:2008-02-29通讯作者:童应凯(1964-,男,青海贵德人,副教授,硕士,主要从事微生物制药与发酵工程方面的研究。E-mail :yingkaitong文章编号:1008-5394(200803-0047-05卑霉素的合成途径及分子生物学进展*任健1,2,童应凯1,通讯作者,吴兆亮2(1. 天津农学院,天津 300384;2. 河北工业大学,天津 300130摘 要:卑霉素为

2、正糖霉素族的寡糖类抗生素,是一种新型的消化促进剂。本文对其理化特征、合成机制做了综述,同时介绍了与卑霉素相关的合成基因、抗性基因和编码糖差向异构作用的基因。 关键词:饲用消化促进剂;卑霉素;合成途径中图分类号:Q753 文献标识码:ABiosynthesis Pathway and Molecular Biology Progress of AvilamycinREN Jian 1, 2, TONG Ying-kai 1, Communication Author , WU Zhao-liang 2(1. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300

3、384, China; 2. Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China Abstract :Avilamycin, a kind of orthosomycin antibiotics, is a new type of digestive enhancer. Its physicochemical characters and biosynthesis pathway were reviewed in this paper. In addition, the biosynthetic genes, resistance gen

4、es and genes encoding epimerization of sugar were introduced.Key words :digestive enhancer ;avilamycin ;biosynthesis pathway卑霉素(avilamycin 简称A VI ,又称阿维霉素、阿维拉霉素,是由绿色产色链霉菌Tü57(Streptomyces viridochromogenes Tü57发酵产生的甲基羟基甲氧基苯甲酸(DCIEA 的一种酯,同扁枝衣菌素类(eveminomycins 、居拉霉素类(curamycins 、火把霉素类(flambam

5、ycins 都属于正糖霉素族(orthosomycin ,又译作奥尔托索霉素的寡聚糖类抗生素。卑霉素已被证实对包括一些致病菌在内的多种革兰氏阳性菌有抑制作用,如万古霉素拮抗的肠道球菌,甲氧苯青霉素拮抗的葡萄球菌以及青霉素拮抗的肺炎双球菌,但它对革兰氏阴性菌的抑制效果差1。此外,卑霉素对大肠杆菌有一种间接作用,即它可以影响细菌鞭毛及细菌的粘附,并通过抑制细菌粘附于宿主粘膜细胞表面而达到抑制细菌感染,从而抑制了疾病的发生2。卑霉素最早是由美国礼来(Lilly 公司的DISTA 厂生产,商品名为效美素(Maxus 100或Surmax ,其中含10%卑霉素,目前已在全球范围内的40多个国家注册。19

6、92年5月14日被日本农业资源审议会正式批准作为饲料添加剂3。作为饲用消化促进剂,卑霉素可以明显促进畜禽的饲料转化率,其促生长效果优于杆菌肽锌。卑霉素已在欧洲、美洲、亚洲、大洋洲等27个国家、地区销售和使用,特别是在美国和日本的使用比例很高。1 卑霉素的理化特征卑霉素为中性、无色针状结晶,熔点为181182 ,微溶于水,易溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯和乙醚等有机溶剂4。发酵得到的卑霉素约有A 、A 、B 、C 、D 1、D 2、E 、F 、G 、H 、I 、J 、K 、L 、M 、N 等十多个组分。在这些组分中, 含量最多的是卑霉素A (分子式为C 61H 88Cl 2O 32,它对梭菌、链球

7、菌和杆菌的抑制效果特别高;其次是卑霉素C (分子式为C 61H 90Cl 2O 32;其它种类的含量不仅很低,且作用很小。上述其它类型都是卑霉素A 的衍生物。卑霉素A 是以糖为骨架的低聚糖(也叫寡糖,即双氯晚霉素酸的一部分(片断A 、D-olivose (片断B 和C 、2-脱氧-D-evalose (片断D 、4-O-甲基-天津农学院学报第15卷·48·D-岩藻糖(片断E、2,6-双-O-甲基-D-甘露糖(片断F、L-来苏糖(片断G和甲基-eurekanate(片断H组成的七糖链(见图1。在经典力场条件下,使用gusLab program package构造和优化低能态的

8、构象514 756。已证实处于松弛态的分子有5个CO单键,它允许分子的主要部分旋转120D,相应产生了35=243种旋转异构体。用Lennard-Jones应用标准van der Waals半径核查它们的原子间是否存在显著交迭作用。结合Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno 和最速下降法优化构象体的几何构型。电脑分析模拟的9个最小能量构象物,有7个构象物的能量处于比绝对最小值高50 kJ/mol的范围之内。它们或形成线形分子(2个,或形成U型(后者中的典型构象见图2514 762。尽管根据分子模型的应用规则,可能的旋转异构体减少了,但只有与其他规则,如功能基团的化学可

9、能性相结合进行分析,才能得到1个唯一具有生物学活性的构象。 注:A-双氯晚霉素酸;B、C-D-olivose;D-2-脱氧-D-evalose;E-4-O-甲基-D-岩藻糖;F-2,6-双-O-甲基-D-甘露糖;G-L-来苏糖;H-甲基-eurekanate图1 卑霉素A的结构式 注:碳原子为灰色,氢原子为白色,氧原子为黑色,氯原子为深灰色图2 卑霉素A的U型构象2 卑霉素生物合成机制的研究进展在合成卑霉素的全部基因簇中,已有54个开放阅读框被测定,这些相应的基因叫avi6。生物合成卑霉素A需要一部分多酮和它的附加结构七糖链(图1。通常认为,卑霉素的生物合成起始于1-磷酸葡萄糖,它在几种酶的作

10、用下被转化为B (dTDP-D-olivese和C(dTDP-2-脱氧-D-evalose (如图3箭头所示。卑霉素生物合成中1个独特的特征是3个不同的NDP-4,6-己糖脱水酶基因的发生。根据序列的同源性,AviEv是一个dTDP-4, 6-葡萄糖脱水酶(dTDP-glucose 4,6-dehydratase,AviE3是1个GDP-4,6-甘露糖脱水酶(dTDP-D- mannose 4,6- dehydrates。这就说明某些糖结构的生物合成起始于与不同核糖连接的己糖库。基于卑霉素的结构和一些基因产物假象功能的支持,L-来苏糖的生物合成开始于第三个糖库,因为它是磷酸戊糖途径的产物。卑霉

11、素A的残基H被认为是甲基eurekanate。序列分析表明,甲基eurekanate也是一个糖在生物合成途径中的产物。基于这个基因簇中基因的假定功能,研究者已经建立起了卑霉素A的各组分的合成模型。卑霉素A的合成途径揭示了更多有趣的特征。如:卑霉素分子中,有2个原酸酯链和1个亚甲基桥(图3。考虑到这些COC排列的氧化特征,编码-酮戊二酸脱氢酶系的AviQ1,AviQ2和AviQ3可能催化这些特殊带的合成。据推断,这些酶是用分子氧作为氧化作用的直接氢受体,通过使用-酮戊二酸作为共同底物生产出最后的COC带、琥珀酸和CO2。卑霉素A己糖通过甲基化作用、乙酸化作用及双氯苔色酸部位和异丁酰部位的改动使6

12、个甲基转移酶基因在基因簇中被表达。对卑霉素的生物合成来说,这一数量已经足够了。然而,其它残基装配所需的基因目前还没有定位。在合成代谢中的AviB1和AviB2与2-oxo酸水解酶复合物组分Z的链和ß链相类似。第3期任健,等:卑霉素的合成途径及分子生物学进展·49 ·图3 卑霉素A的生物合成途径这个复合物通常是由3部分酶单元构成,分别是依赖焦磷酸硫胺素的脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶。编码这些复合物元件后来成分的开放阅读框既不是定位在基因簇内部,也根本不需要参与到卑霉素A的生物合成中。合成示意图见图3。对于卑霉素的合成,还有以下几点值得注意。(11-

13、磷酸葡萄糖、GDP-D-甘露糖和5-磷酸核糖是卑霉素A的共同前体,在发酵试验的后期,加入适量的前体物质,有利于卑霉素A的合成。(2卑霉素A各组分之间的连接是通过2个原酸酯链和1个亚甲基桥,以及一些特殊的COC带完成的。但是Hofmann认为,卑霉素的生物合成是由合成戊糖L-来苏糖开始的,接下来则是七糖链的形成。首先,来苏糖和甘露糖相结合,然后eurekanate再结合到L-来苏糖上。在aviE2中作插入突变,使其编码UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶,并参与到由葡萄糖转变为来苏糖的生物合成中,结果减弱了卑霉素A的合成,从而证明了卑霉素的合成是从来苏糖和甘露糖的结合开始的假设7。3 卑霉素分子生物学的研究

14、进展用绿色产色链霉菌Tü57的染色体DNA作为模板,获得了1个PCR片段。使用这个PCR片段作为探针,来测定1个质粒文库。在绿色产色链霉菌Tü57中有1个大小为65 kb 的DNA区域,该区域包括编码卑霉素生物合成中的蛋白质的基因8。将探针上的粘粒进行杂交,检测出这一区天津农学院学报第15卷·50·域中1个6.4 kb的DNA序列含有4个开放阅读框架(ORF1至ORF4,其中3个完全包含所测序出来的片段(即aviD、aviE和aviM9-11。据推断,AviD的氨基酸序列是由ORF3编码的,此序列与StrD(即灰色链霉菌的一个dTDP-葡萄糖合成酶有62

15、%的同一性;AviE的氨基酸序列由ORF4编码,此序列与StrE(即灰色链霉菌的一个dTDP-葡萄糖脱水酶有55%的同一性。对aviE 基因进行插入失活实验导致卑霉素的产量降低了,这就证实aviE存在于卑霉素的生物合成中12-14;AviM的氨基酸序列是由ORF2编码的,此序列与青霉棒曲霉素中6-甲基水杨酸合成酶有37%的同一性。多功能基因aviM在S. lividans TK24或S. coelicolor CH999上表达,结果产生了苔色酸。据研究,aviN位于aviM的上游,编码了一种蛋白酶,该酶是控制苔色酸生物合成的起始单位。在卑霉素的生物合成中,又测序出一些基因而且已被定性。其中有2

16、个基因,即aviG4和aviH。当从苔色酸生成双氯晚霉素酸时,需要甲基化和双卤化作用,这说明AviG4和AviH负责修饰苔色酸。因为AviG4类似于DmpM(链霉菌的一种甲基转移酶,而AviH与PL5A(一种卤化酶相似。同时,G.Weitnauer等的研究表明,产绿色链霉菌Tü57是主要的产卑霉素A的微生物,其中aviG1是一个甲基转移酶基因,它是从卑霉素生物合成基因簇中检测出来的15-16。为了测定AviG1的功能,进行了aviG1与eryB突变体的互补实验,而这个突变体来自产多孢子酵母红斑菌的红霉素A。在培养互补突变体的上层清液中存在红霉素A,这表明,L-红霉糖生物合成可以被修复

17、,而且,aviG1可以代替编码C-甲基转移酶的eryB的功能17-20。通过转甲基酶基因的基因中断实验,得到了一种水溶性更好、新的卑霉素衍生物,定名为gavibamycins。敲除aviB1和aviO2(编码丙酮酸酯脱氢酶复合体一部分后,得到一种卑霉素衍生物,它没有卑霉素A中 eurekanate的C-4位点上的末端残基乙酰基。同样,使可能编码糖基转移酶的aviGT4基因失活,则会导致产生的卑霉素衍生物结构中缺失eurekanate末端残基。因而,对卑霉素的产生有影响的基因主要有aviM、aviD、aviE、aviG1、aviG4和aviH。进一步的研究表明,绿色产色链霉菌Tü57的

18、卑霉素生物合成基因簇上的几个不同的抗性因子(aviRa、aviRb、aviABC1和aviABC2已被分离出来,当在S. lividans TK66上表达时便赋予了卑霉素抗性,AviABC1的氨基酸序列分析显示出它很像疏水性透膜蛋白质,此蛋白质与ATP-结合蛋白共同作用;AviRb的氨基酸序列分析表明它与rRNA甲基转移酶相似;AviRa的氨基酸序列分析表明它不与任何蛋白质相似21。当aviABC1与aviABC2、aviRa、aviRb在S. lividians TK66中独立表达时,在浓度分别为5、10、250 mg/L的条件下,对卑霉素有不同水平的抗性22。当aviRa 与aviRb或者

19、aviRa、aviRb、aviABC1与aviABC2在S. lividans TK66中共表达时,卑霉素抗性水平可达到250 mg/L。因而,影响卑霉素抗性的基因主要有aviRa、aviRb、aviABC1和aviABC2。在合成卑霉素的基因簇中,有一些基因的功能不能忽视,aviX12就是其中之一。它位于基因簇的中心,与转甲基酶基因和糖的合成基因相邻。蛋白AviX12与已知功能的蛋白没有显著相似性,但它含有基本的S-腺苷甲硫氨酸蛋白家族(radical AdoMet的主要序列。腺苷甲硫氨酸蛋白家族与其他蛋白一起参与氧化过程,并在卑霉素的生物合成中促使蛋白AviX12改变结构,从而使其更容易发

20、生氧化反应,如在eurekanate moiety末端建立亚甲基桥或直酯联接。研究者使aviX12失活,测定了由此变异体得到的卑霉素新衍生物的结构。结果显示,AviX12通过催化一个异常的差向异构作用,促使了卑霉素A生物活性结构的形成,证明AviX12是具有糖差向异构作用的AdoMet家族的一例蛋白514 759。参考文献:1 Wright E D. The orthosomycins, a new family ofantibioticsJ. Tetrahedron,1979,35(10:1 207-1 236.2 王丽纹. 泰乐菌素和阿维拉霉素对大肠杆菌的粘附性能的影响J. 中国饲料研究,

21、2002(4:28-29. 3 徐积恩. 饲料添加剂卑霉素J. 饲料,1993,132(7:77-82.4 Weitnauer G, Gaisser S, Kellenberger L,et al. Analysisof a C-methyltransferase gene(aviG1 involved in avilamycin biosynthesis in Streptomyces viridochromogenes TÜ-57 and complementation of a Saccharopolyspora erythraea eryBIII mutant by aviG

22、1J.Microbiology,2002,148:373-379.第3期任健,等:卑霉素的合成途径及分子生物学进展·51·5 Raija Bol,Carsten Hofmann,Björn Heitmann,et al. Theactive conformation of Avilamycin A is conferred by AviX12,a radical AdoMet enzymeJ. J Biol Chem,2006, 281(21:14 756-14 763.6 Weitnauer G. An ATP-binding cassette transpor

23、ter andtwo rRNA methyltransferases are involved in resistance to Avilamycin in the producer organism Streptomyces viridochromogenes Tü57J. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45(3:690-695.7 Treede I,Hauser G,Hofmann C,et al. Genes involved information and attachment of a two-carbon chain as a com

24、ponent of eurekanate, a eranched-chain sugar moiety of Avilamycin AJ. Appl Envir Microbiol,2005,71(1: 400-406.8 Weitnauer G,Muhlenweg A,Trefzer A,et al .Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin A: deductions from the molecular analysis of the avi biosynthetic gene cluster of Streptomyc

25、es viridochromogenes Tu57 and production of new antibioticsJ. Chem Biol,2001,45(6:569-581. 9 Peter V A,Wenjun Zhao,Todd A B,et al . Mutations inribosomal protein L16 conferring reduced susceptibility to evernimicin(SCH27899:implications for mechanism of actionJ. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(3

26、: 732-738.10 Carl Urban,Noriel Mariano,Kathryn Mosinka-Snipas,et al. Comparative in-vitro activity of SCH 27899 , a novel everninomicin , and vancomycinJ. J AntimicrobChemother,1996,37:361-364.11 V ara J,Lewandowska-Skarbek M,Wang Y G,et al.Cloning of genes governing the deoxysugar portion of theery

27、thromycin biosynthesis pathway in Saccharopolysporaerythraea (Streptomyces erythreusJ. J Bacteriol,1989, 171:5 872-5 881.12 Bult,White O,Olsen G J,et al. Complete genomesequence of the methanogenic archaeon, MethanococcusjannaschiiJ. Science,1996,23:1 058-1 073. 13 Brawner,Auerbach JI,Fornwald JA,et

28、 al.Characterization of Streptomyces promoter sequences using the Escherichia coli galactokinase geneJ. Gene,1985,40:191-201.14 Adams,Wagner L M,Graddise T J,et al. Nucleotidesequence and genetic characterization reveal six essential genes for the LIV-I and LS transport systems ofEscherichia coliJ.

29、J Biol Chem,1990,265:11 436-11 443.15 Peter C Fuchs,Arthur L Barry,Steven D Brown. In vitroactivities of SCH27899 alone and in combination with17 other antimicrobial agentsJ. Antimicrob AgentsChemother,1999,43:2 996-2 997.16 Salah-Bey,Doumith,Michel,et al . Targeted geneinactivation for the elucidat

30、ion of deoxysugarbiosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraeaJ. Mol Gen Genet,1998,257:542-553.17 Paulus,Tuan,Luebke,et al . Mutation and cloning oferyG,the structural gene for erythromycinO-methyltransferase from Saccharopolyspora erythraea ,and expression of eryG in Escherichia coliJ. JBacteriol,1990,172:2 541-2 546.18 Rowe,