中山大学生化课件中文译本（Word）

1、上学期§1 生物化学绪论和基础 (郑利民)§2 氨基酸与蛋白质 (李国富)§3 蛋白质的结构(李国富)§4 蛋白质的功能(李国富)§5 蛋白质研究的基本方法(李国富)§6 酶(李国富)§7 糖(李国富)§8 核苷酸与核酸(李国富) §9 脂(李国富)§10 生物膜与物质转运(李国富)§11 生物信号(郑利民)§12 生物体对环境应答的生化基础(郑利民)下学期第一部分、静态生化结构和催化作用 第一节：氨基酸、多肽和蛋白质 第二节：蛋白质的三维结构 第三节：蛋白质的功能和分离纯化

2、，测序 第四节：酶 第五节：核苷酸和核酸 第六节：糖和糖生物学 第七节：脂类和生物膜 第八节：微生物、抗生素和激素第二部分、动态生化生物能学和代谢 第九节：糖酵解和己糖的分解代谢 第十节：三羧酸循环 第十一节：氧化磷酸化 第十二节：糖异生和糖原代谢 第十三节：脂肪酸的氧化及合成 第十四节：蛋白质的降解和氨基酸的氧化及合成 第十五节：核酸的降解及核苷酸代谢第三部分、分子生物学信息途径 第十六节：DNA 的复制、修复和重组 第十七节：RNA 的合成加工和遗传密码 第十八节：蛋白质的合成及转运 第十九节：基因表达的调控 第二十节：基因工程及蛋白质工程1 / 107历年考研真题&部分其它院校考

3、研真题三复习重点和复习建议很多考生认为生物化学的考试重点在下半册，也就是代谢部分，因此往往忽略对上半册的复习。然而从我们中大生科院近六年（0409）的研究生入学考试试题来看，上半部分结构和催化约占280 分/750 分，即37.3；其中07、08 年更是占了40以上，所以大家一定要重视这部分。在上半部分中，蛋白质的功能、蛋白质的分离纯化和酶为重点，80以上考题集中在这里。其实这与近年来由基因研究转向蛋白质的研究，大家越来越重视蛋白质是密不可分的。因为代谢部分需要理解和记忆的东西很多，比如各步反应底物、产物、酶和催化机制等等，所以学习起来有一定的困难度。老师在授课时就难免会强调学习这部分时需要努

4、力的重要性，这就往往给我们造成错觉，认为这一部分是主要考点。实际上这部分在近六年（0409）中大研究生入学考试试题中所占的比重只有190 分/750 分，即25.3。因为研究生学习来说，代谢这一部分的内容在大家以后的研究生涯的中往往是很少接触到的。特别是中大生科院，除了微生物专业的一位做工程菌的改造老师需要专业的代谢知识外，其它大部分研究者所做的都是核酸蛋白，因此我们在研究生入学考试中，对代谢部分的考查并不多。在代谢部分所占的25左右的题目中，脂肪酸的代谢是重点，无论是填空、判断还是问答都比较多，大家一定要注意。至于第三部分，生物信息途径，也就是分子生物学，约为280 分/750 分，即37.

5、3，与第一部分静态生物学所占比例差不多，而且在近年中大研究生入学考试中所占的比例也有逐年增加的趋势，是复习的重点。四本讲义说明本讲义以中山大学生科院本科生生物化学课程讲义为基础，整合了近几年年暑期班的生化讲义、中山大学分子生物学课程讲义以及基因工程课程讲义，力求涵盖到所有的考点。在理解的基础上，以关键词的方式记忆所学内容是一种简便高效的方法，并且能够有效的加快复习进程。因此，在我们的网络课程中，许多考点都以红色或蓝色字体加以标记，便于学员记忆。正是因为如此，我们要讲的所有内容几乎都会在ppt 上以文字或图表的形式呈现给学员，因此当学员需要再度复习的时候，建议参考ppt 即可，毕竟全部都是文字的

6、讲义是比较枯燥的。在本课程中，每一节后面还给学员准备了一定量的练习题，这些题目部分出自中大本科生课程练习题或期中期末考试题，部分出自其它院校的比较典型的考研题目，建议大家认真练习。在编制本讲义的过程中，虽然力求做到条理清晰、严谨正确、不失重点，并也因此参考了大量的相关资料，但因为知识的局限和时间的紧迫，难免有所疏漏甚至错误，希望学员批评指正。第一节.氨基酸、多肽和蛋白质Polar AAs (hydrophilic)serineSerSthreonineThrTcysteineCysCtyrosineTyrYasparagineAsnNglutamineGlnQElectrically Char

7、ged (negative and hydrophilic)Aspartate AspDGlutamateGluEElectrically Charged (positive and hydrophilic)lysineLysKarginineArgRhistidineHisHamino acid3 letter code1 letter codeglycineGlyGalanineAlaAvalineValVleucineLeuLisoleucineIleImethionineMetMphenylalaninePheFtryptophanTrpWprolineProPNonpolar AAs

8、 (hydrophobic)Yellow amino acids contain sulfur. Green amino acids can be phosphorylated.1氨基酸1.1结构特征l 标准氨基酸：至少有一羧基（carboxyl）和一氨基连接在同一个碳原子上（该碳原子称为-碳原子）。l 注意，脯氨酸含亚氨基。l 构成蛋白质的氨基酸是20种标准氨基酸（可能含有非标准氨基酸，标准氨基酸经修饰而形成的）。最近又发现了两种标准氨基酸。l 标准氨基酸中，1806年发现第一种氨基酸天冬酰胺，1938年发现最后一种苏氨酸。l -碳采用sp3杂化，键角109.5°。l -碳是手性中

9、心（大多数情况下，只有-碳是手性中心；甘氨酸无手性，因R基为H）。其绝对构型采用D,L系统，建立在L-甘油醛（L-glyceraldehydes）和D-甘油醛的结构之上。l D、L构型与其实际的旋光性无关。l 到目前为止在蛋白质中发现的氨基酸都是L的（酶的活性位点是不对称的，即酶促反应是在手性环境下进行的），D仅存在于细菌细胞壁上的短肽和抗生素小肽。1.2分类l 非标准氨基酸是标准氨基酸的衍生物（derivative）。l 根据R基的不同性质将氨基酸进行分类，按其极性或在生理pH（近7.0）下与水相互作用的趋势分为5类：非极性脂肪族、芳香族、极性不带电、带正电（碱性）、带负电（酸性）。l 非极

10、性脂肪族：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸。（衣架凉鞋饼干异亮、甲硫、亮、缬、丙、甘）l 芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。（食老本（粤语）色、酪、苯丙）l 极性不带电：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺。（诗书伴琴谱丝、书、半胱、脯；天冻先安谷天冬、酰胺、谷）l 带正电：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。（组队来京晋见组、赖、精、碱性）l 带负电：天冬氨酸、谷氨酸。（天上的谷子很酸天、谷、酸性、都是氨酸）l 酪氨酸苯环上有羟基；丝氨酸和苏氨酸有羟基；半胱氨酸有巯基可成对形成二硫键；组氨酸是唯一一个具接近的pKa值电离侧链的氨基酸，常作为质子供体和受体；天冬氨酸和谷氨

11、酸都有两个羧基。l 含芳香族R基的氨基酸能强烈吸收紫外光，使许多蛋白质在280nm处有特征性强烈吸收。l1.3 化学属性1.3.1滴定曲线（titration curves）l 氨基酸是两性物质。脱氢时先脱羧基再脱氨基。对于含单一-羧基、-氨基和不离子化的氨基酸而言，羧基脱氢后氨基脱氢前为等电点（isoelectric point）。pI（pK1pK2）/2l 只有组氨酸的R基（pKa6.0）在中性pH下提供显著缓冲能力。l 所有非末端残基的-羧基、-氨基共价形成了肽键，不发生离子化，对于多肽总的酸碱行为无贡献。1.3.2特征反应l 茚三酮能使氨基酸显蓝色（脯氨酸显黄色）1.4氨基酸的分离l

12、可用离子交换层析2 肽与蛋白质2.1氨基酸链l 脱水缩合反应（condensation reaction）的自由能差为5kcal/mol，但无法自发进行。在标准生化条件下，平衡有利于向反应物移动。为使反应在热力学上更为有利，羧基必须被化学修饰或活化，使羟基更易离去。l 肽键极稳定（虽水解时放能，但活化能高），在无催化剂存在的水溶液中可维持1000年，在大多数细胞内环境下半衰期为7年。l 一般认为，少于50个氨基酸缩合成肽称寡肽，50100个的称多肽（或相对分子质量低于10000）l 20种标准氨基酸的平均分子质量为138，但在蛋白质中，小分子量氨基酸在数量上占优势，平均下来为128，脱水缩合时

13、再脱去一分子水的18，剩下110。l 缩合时是从N-端开始的，因此在书写时习惯将N-端放在左边。l 短肽可构成神经递质、激素、抗生素等。2.2辅基l 有些蛋白质除了氨基酸之外还含有其它永久连接的基团（辅基，可以不止有一个），这样的蛋白称结合蛋白。辅基可以是脂类、糖类、金属等。l 脱去辅基的蛋白称apoprotein（脱辅基蛋白）2.3物种间的蛋白同源性l 在不同物种中，氨基酸序列的一些特定位置总被相同的残基占据，这些残基称不变残基。而另外一些位置则表现出可变性，这些残基称可变残基。l 某些位置的替换大多发生在类似的残基间，称为保守替换。l3蛋白质的处理3.1分离和纯化l 根据蛋白质的溶解性、分

14、子量、带电性、亲和性（binding affinity）的不同，可分离、纯化蛋白。柱层析就是利用这个原理来做的。高效液相层析（HPLC）利用高压泵加速蛋白质分子沿着柱子向下运动，通过减少过柱时间，可限制蛋白质条带的扩散，提高分辨率。l 分离纯化的一般步骤：组织匀浆（homogenization）过滤（filtration）粗提取（crude extract）盐析（salting out）离心（centrifugation）透析（dialysis）柱层析（column chromatography）l 盐析常用硫酸铵，因其具有高度水溶性。可用透析法去除硫酸铵。l 分离纯化时，一般先选择廉价、简单

15、的程序再选择昂贵、复杂的程序。l 离子交换层析（ion-exchange chromatography）：利用一定pH下不同蛋白质带电的种类和电量存在差异，与柱介质上的离子结合力不同来做的。柱有阴、阳离子交换树脂两种。l 大小排阻层析（size-exclusion chromatography）：又称凝胶过滤（gel-filtration），柱介质有选择孔径的聚合物。大的蛋白质比小的蛋白质走得快（因小蛋白可以钻小孔，路径曲折）。l 亲和层析（affinity chromatography）：通过结合特异性来分离蛋白质。柱介质上含有配体能特异性结合某些蛋白。l 疏水相互作用层析（hydropho

16、bic interaction chromatography）：根据不同蛋白质的疏水性的强弱来做的。溶液中高离子强度可增强蛋白质与疏水性柱介质之间的疏水作用，线性或阶段降低离子强度可选择性地将样品解吸。3.2电泳（electrophoresis）l 蛋白质电泳普遍在聚丙烯酰胺凝胶中进行。大体上按照蛋白质的荷质比来移动，蛋白质的形状对移动也有影响。l 十二烷基磺酸钠电泳（SDS-PAGE）常用来估测蛋白质的纯度和分子量。SDS结合蛋白质的量基本与分子量成正比，结合的SDS提供大量负电荷使蛋白本身的电荷不明显，使荷质比相同，同时也改变蛋白质的构象呈相同的形状，于是移动性完全由质量来决定（小蛋白比较

17、快）。电泳后再用考马斯亮蓝（Bradford法考马斯亮蓝G-250与蛋白结合而不与胶结合，在游离状态下呈红色；当它与蛋白质结合后变为青色。灵敏，方便）染色。若蛋白含有亚基，则会被分开形成各个亚基的条带。l 等点聚焦电泳（IEF）用来确定蛋白质的等电点。通过低分子量的有机酸碱混合物在外加电场的凝胶中分布形成一个pH梯度。于是蛋白质会移动到与pI相等的pH处停下。l 双向电泳结合等点聚焦和SDS电泳，能提高分辨率。可分离相同分子量而等电点不同的蛋白质，或相同等电点而分子量不同的蛋白质。l 电泳一般不用于纯化大量蛋白质，因电泳对蛋白质结构不利。3.3测序（sequencing）l 测序的一般步骤：分

18、析氨基酸组分打开二硫键（disulfide bond）切割长肽为短肽短肽测序短肽排序定位二硫键。l 分析氨基酸组分：将肽链彻底水解（6mol/L HCl，110，24h），后用离子交换层析（或HPLC）分离，后根据吸收峰来确定组分和含量。l 打开二硫键：可用过甲酸来氧化断键，或用二硫苏糖醇还原断键再用碘乙酸来乙酰化防止再度形成二硫键。l 肽链切割：用溴化氰或蛋白酶来切割。胰蛋白酶切Lys，Arg（C）；胰凝乳蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（C）；胃蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（N）；溴化氰切Met（C）。l 短肽测序：Edman法。l 短肽排序：比较多套片断，推理得出原来的完整序列。l 定位

19、二硫键：将原来的蛋白样品作同样切割但不打开二硫键，然后电泳比较，比较条带即可知道二硫键所在区域。l 现在很多氨基酸序列是通过分析其DNA序列来确定的。3.4化学合成l 含150个氨基酸残基的短肽可被化学合成。l 化学合成的速率远低于生物合成。3.5质谱法（mass spectrometry）l 省略自己看书去第二节.蛋白质的三维结构1蛋白质结构综述l 蛋白质折叠与非折叠状态的自由能差在2065kJ/mol之间。l 二硫键的强度虽比单独的弱的相互作用力（weak interaction）强，不过由于弱的相互作用力数量多，因此它才是维持蛋白质稳定的主要作用力。它包括：氢键（hydrogen bon

20、d）、静电力（static electrical force）、范德华力（Van der Waals force）、疏水相互作用力（hydrophobic interaction）。l 蛋白质折叠的自由能降大部分来自于水的熵增加（疏水相互作用）。l 折叠规律：疏水残基大部分埋在蛋白质内部远离水；氢键数最大化。l 肽键具刚性（rigid）和平面性（planar）。肽键的CN键不能自由旋转。l CN由于共振作用具有部分双键的性质。羰基氧带部分负电荷，氮带部分正电荷，形成小的电偶极子（electric dipole）。2蛋白质的二级结构2.1螺旋（-helix）l 每个螺旋含有3.6个氨基酸残基，螺

21、距5.4Å，每个氨基酸残基升高5.4÷3.61.5Å，旋转100°。l 目前已知的-helix均为右旋。l -helix最佳利用了内部氢键。l 形成-helix的氨基酸必需手性相同。l 5个因素决定-helix的稳定性：R基间的静电作用力；R基间的空间位阻；相隔34个残基的侧链间的相互作用力；脯氨酸（N为刚性环的一部分不利螺旋）和甘氨酸（柔性）的出现；螺旋片断末端的氨基酸残基相互作用和螺旋固有电偶（螺旋两端的4个残基不完全参与形成螺旋氢键，C端带负电N端带正电）。2.2折叠片层（-pleated sheet）l 有反平行（antiparallel，CN

22、/ NC / CN交替出现）和平行（parallel，CN / CN / CN）两种形式。反平行的自由能可能低一些，因氢键无角度，强度更大。l 同一条肽链也可有-pleated sheet。如图：反平行平行l R基间距离约为3.5Å。反平行构象的周期为7Å，平行的为6.5Å。2.3转角（-turn）l 包含4个氨基酸残基的180°转角。第一个残基的羰基氧和第四个残基的氨基氢之间形成氢键，中间两个残基不参与残基内部氢键的形成。如反平行的-pleated sheet末端是-turn。（转角是由3个氨基酸残基构成的，相当少见。）l 甘氨酸和脯氨酸常出现于-tu

23、rn中，因前者较小且具柔性，后者能异构成顺式。l -turn常出现在蛋白质近表面，因中间两个残基的肽基团可以与水形成氢键。3蛋白质的三级结构（tertiary structure）和四级结构（quaternary structure）l 三级结构：一条肽链的空间结构或n条之间有共价键（二硫键）的肽链的空间结构。l 四级结构：n条肽链，且之间不形成共价键。3.1纤维蛋白（fibrous protein）l 纤维蛋白一般为结构蛋白，提供力量和/或柔韧性。均不溶于水。3.1.1-角蛋白（-keratin）l -角蛋白组成头发、毛绒、指甲、爪趾、刺、角、蹄和皮肤外层。l -角蛋白是右手-helix，超

24、卷曲（两条链）是左手的。超卷曲中-角蛋白方向平行。l 超卷曲中两条-helix的接触面由疏水氨基酸残基组成，包括Phe、Ile、Val、Met、Leu和Ala。R基相互啮合成规则的互锁模式。l 通常强度较大的-角蛋白，含有较多Cys，因可形成二硫键。如龟壳和犀牛角约含18的Cys。l -角蛋白具有弹性，可拉伸为原长度的2倍。3.1.2胶原蛋白（collagen）l 胶原蛋白的二级结构非常独特，含有左手的-chain（三股螺旋，不是-helix），一圈3个残基。3股-chain形成右手三链螺旋。（角蛋白中是两股右手螺旋以左手的方式形成超螺旋.胶原蛋白有类似的三螺旋,但肽链自身是左手螺旋,其三条肽

25、链以右手螺旋的方式构成超螺旋,其2级结构称 -chain ）l 胶原中的氨基酸序列大体上是三肽的重复结构，即Gly-X-Pro或Gly-X-HyPro（X是任意氨基酸残基，HyPro是羟脯氨酸）。l 只有Gly可以容纳于各个-chain（左手螺旋）间非常紧密的连接中。脯氨酸使胶原螺旋形成尖锐的扭曲。l 不存在链内氢键，只有链间氢键。l 每个氨基酸升高2.9Å，约3个氨基酸为一圈。l -chain间和胶原分子间通过独特的共价键交联，涉及Lys和HyLys（羟脯氨酸）或His残基。l 胶原三股螺旋中的-chain超卷曲产生的张力大于同截面的钢绳。3.1.3丝心蛋白（silk f

26、ibroin）l 丝心蛋白由昆虫和蜘蛛产生，其多肽链以富含Gly和Ala的-pleated sheet为主，其R基（H和CH3）可以交互排列、堆积紧密。l 整体结构的稳定由-pleated sheet肽链间的大量氢键和范德华力的优化来维持。l 丝心蛋白已不可再拉伸，因-pleated sheet已经高度伸展。柔韧性高，因片层的连接是靠弱的相互作用力，不像-keratin（-角蛋白）用二硫键。3.2球蛋白（globular protein）l 球蛋白多为功能蛋白，如酶、转运蛋白、动力蛋白、调节蛋白、免疫球蛋白等。3.2.1肌红蛋白（myoglobin）l 肌红蛋白含153个氨基酸残基和一个铁离子

27、原卟啉（亚铁血红素基团，heme），功能是贮存氧气并协助氧在急速收缩的肌肉组织中扩散。l 肌红蛋白有一个密集的疏水核心，含Leu、Val、Met、Phe等。分子内部仅有两个亲水的（hydrophilic）组氨酸残基。l 除了两个极性R基外，其它所有的极性R基均在分子外表与水结合。（注意，非极性的也能在表面）l 扁平的亚铁血红素基团位于肌红蛋白的一个裂缝（口袋）中。亚铁的6个配位键，4个结合到平面的卟啉环上，另外两个与环垂直，一个与His残基的N结合，一个与O2结合。l 在口袋中的血红素基团不易与溶剂接触，从而保证Fe2不会被氧化成Fe3（无法与O2结合）。3.3结构模式3.3.1结构域（dom

28、ain）和超二级结构（supersecondary structure）l 残基数超过几百的多肽常折叠成两个或更多的稳定的球状单元，称为domain（结构域）。许多domain独立折叠成热力学上最稳定的结构，有些有各自独特的功能。l - loop与- corner能使疏水R基处于内部。l -helix与-pleated sheet通常存在于不同结构层，因无法形成稳定氢键。l 一级序列相互接近的多肽片断通常在折叠后也相邻堆叠。l 二级结构单元间的连接不能形成交叉或结节。（如很长的-pleated sheet可以绕来绕去但是不能有打结的趋势）l 当各个片断以右手螺旋略微扭曲时，-pleated s

29、heet最稳定。右手连接比左手连接短，弯曲角度更小。这样的扭曲会形成桶（ barrel）和扭曲的-pleated sheet。3.3.2蛋白质的基序（motif）是蛋白质分类的基础。l 按基序可降低三级结构的复杂性。分为4类：全，全，与交错（/），与明显可分（）3.3.3四级结构l 多亚基蛋白称为多聚体（multimer），少数亚基组成的多聚体称为寡聚体（oligomer）。l 大多数多聚体以对称方式重复排列相同的一个或组亚基（原体）。l 寡聚体具有旋转对称性或螺旋对称性：一个亚基绕一条或多条旋转轴或一条螺旋轴旋转后可以和其它亚基重合。l 蛋白质的大小受到2个因素限制：基因的编码容量和蛋白质生

30、物合成中的精确性（大的蛋白质包含一个错误氨基酸的几率大于小蛋白质）。4蛋白质的变性（denaturation）和折叠（folding）4.1结构缺失导致功能缺失l 导致蛋白质功能丧失的三维结构破坏称为变性。l 变性完全去折叠或构象随机化。通常变性后蛋白质以部分折叠的状态存在。（目前还不是很清楚的说）l 加热破坏氢键还有其它弱的相互作用力，使蛋白质变性。l 加热时，蛋白质会在某个狭窄的温度范围内突然变性，表明去折叠是一个协同过程。l 极端pH、有机溶剂（如乙醇、丙酮、尿素、盐酸胍）以及去污剂等也能使蛋白质变性。极端pH改变蛋白质所带的静电荷引起静电斥力和某些氢键的断裂；后两者主要破坏产生球蛋白稳

31、定核心的疏水相互作用。l 某些变性是可逆的。恢复活性的过程称为复性（renaturation）。4.2蛋白质按步骤迅速折叠l 从热动力学上说，折叠过程可被看成一种自由能漏斗。l 某些蛋白质的折叠在其它蛋白质（分子伴侣，molecular chaperone）的辅助下进行。分子伴侣提供折叠所需的微环境或加速正确折叠。l 目前研究比较透彻的有两类分子伴侣：Hsp70蛋白家族和陪伴蛋白（chaperonin）。前者能和富含疏水残基的未折叠区域结合组织，阻止不恰当聚集，还有能封闭某些蛋白质使其不能折叠，保证这些蛋白质在跨膜定位之前保持去折叠状态；后者为许多不能自发折叠的胞内蛋白提供了所需的微环境。l

32、某些蛋白质的折叠需要两种异酶：蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）和肽链prolyl顺反同分异构酶（peptide prolyl cis-trans isomerase，PPI）。前者催化二硫键交换和改组直至形成天然构象中的化学键（包括催化排除错误成键的中间折叠体），后者催化脯氨酸顺反异构体间相互转化。4.3错误折叠引起的死亡l 朊病毒。5研究蛋白质3D结构的方法l 目前测定蛋白质3D结构的方法有透射电子显微镜技术（Transmission Electron Microscope, TEM）、X射线衍射（X-ray diffraction）和核磁

33、共振（NMR）。l 三种方法的对比请看大一上学期生技进展的笔记整理。6 结语l 氨基酸序列决定3D结构l 结构决定功能l 每种蛋白质有其独特的结构。l 维持蛋白质结构的不是共价相互作用，而是弱的相互作用力。l 蛋白质错综复杂的结构是由一定的基序构成的。第三节.蛋白质功能和分离纯化，测序1一般特征l 配体（ligand）：与蛋白质发生可逆结合的分子，可以是各种分子，如蛋白质。l 结合位点（binding site）：蛋白质上与ligand结合的位点。结合位点与配体在大小、形状、电荷、疏水性亲水性等性质方面是特异性互补的。（当然这里排除了水，它与蛋白质许多部位有微弱的、非特异性的结合）l 蛋白质和

34、配体间的结构适应称为诱导契合（induce fit）。l 蛋白质有柔性，主要表现为异构和氨基酸的微小移动。l 其它配体结合而导致的构象变化将影响第一配体的结合。l 蛋白质和配体的结合可以用配体结合曲线定量描述。Ka称为结合常数（association constant），Kd称为解离常数（dissociation constant）。当配体浓度LKd时，一半的结合位点结合上配体。为使90的位点被结合，L需比Kd至少大9倍。2 氧结合蛋白（oxygen-binding protein）2.1肌红蛋白（myoglobin）l 胶体中氧的溶解度极低，因此多细胞大型动物进化出以蛋白质来贮存和运输氧的机

35、制。铁和铜对氧具有较强结合能力。l 铁整合在含血红素（heme）辅基（prosthetic group）的蛋白质中。没有一种AA侧链是适合与于氧可逆结合的。l 血红素1个原卟啉（卟啉的一种；卟啉由4个吡咯和4条次甲桥成环）1个亚铁。原卟啉与亚铁的4个配位键结合。亚铁的另两个配位键分别垂直于卟啉环两面，其中一个与His F8残基侧链的N结合，另一个与O2结合。4个吡咯上的N能抑制亚铁氧化（Fe2可结合O2而Fe3不可）。O2的一个氧原子和Fe2配位，另一个与His E7（His64）形成氢键，更有利于O2结合。l CO、NO的对heme的亲和力大于O2。CO与游离heme的结合力和与蛋白质结合的

36、heme的结合力是不同的，后者更低，这种差异部分由位阻造成。因当与Fe与O2结合时，FeO键与OO键成一定角度倾斜且O与His E7成氢键，而当Fe与CO结合时，FeC键与CO键无角度，完全垂直，所以His E7对其有位阻。l His E7侧链旋转可以使蛋白质瞬间产生空腔，使氧进出。2.2血红蛋白（hemoglobin，Hb）l Hb有4个氧结合位点，而肌红蛋白只有1个。l Hb是第一个被结晶，明确生理功能、分子量的蛋白，其mRNA最先被分离、测序，第二个获得3D结构的蛋白。l Hb是四聚体蛋白，含4个heme，两条链和两条链，类似与4个myoglobin的结合。1与1结合紧密（30个AAs）

37、而1与2结合较弱（19个AAs）。链的接触面主要是疏水作用，另外还有氢键、盐桥。l Hb有Relaxed state和Tense state两态。R state对氧的亲和力更高；缺氧时，T state稳定，是脱氧血红蛋白（deoxyHb）的主要构象。T state的heme向His F8突出，R state的heme为平面。heme周围关键AAs侧链的位置变化能引起T state向R state转化，如F螺旋位置的移动。+l Hb是一种别构蛋白（allosteric protein，配体与一个位点的结合会影响同一蛋白内其它位点的结合能力），其氧合曲线是S形的。单一binding site的单亚

38、基蛋白不可能产生S形曲线，即Kd不会改变，无所谓分子内的影响。Hb中，一旦O2与第一个亚基结合，第二个亚基更容易转化为R state，依此类推。l 在较低的氧分压下（如外周组织中），Hb对O2的亲和力低，释放O2；在较高的氧分压下（如肺部中），Hb对O2的亲和力高，结合O2。l 效应物（modulator）：一种和别构蛋白结合并影响其对配体的结合力的分子。l 同促效应（homotropic interaction）：正常配体和效应物为相同时的作用。异促效应（heterotropic interaction）则反之。有些蛋白可以有多个modulator所以可以同时有同促效应和异促效应。l 协同结

39、合（cooperative binding）机制仍不清楚，有两个模型：齐变模型（concerced model，MWC model）和序变模型（sequential model）。l Hb也能运输H和CO2。CO2在碳酸酐酶（carbonic anhydrase）的催化下，和水反应生成HCO3和H。低pH高CO2的外周组织中，随着CO2和H与Hb结合，其对氧的亲和力降低，释放O2。在肺部则反之。这种pH和CO2浓度对Hb结合、释放O2的影响称波尔效应（Bohr effect）。l 甘油酸-2,3-二磷酸（BPG）与Hb存在异促效应。BPG会大大降低Hb对氧的结合力（在肺部的影响小而在组织中影响

40、大），它是通过稳定T state来实现的。一分子Hb仅结合一分子BPG。l 胎儿的22 Hb对BPG的亲和力较低，相应地对O2有较高亲和力。l 大多数Hb的AAs序列突变是单个AA的突变，对Hb的结构和功能影响很小。但也会引起有害突变（主要发生在heme pocket附近和链的接触面），如镰刀型细胞贫血症（两条链上的6位Glu突变为Val共少了两个负电荷，使得链上产生了一个“黏性”的疏水接触点，使得蛋白之间不正常缔合形成长链，造成贫血。镰刀型的细胞还能堵塞毛细血管，引起炎症和疼痛）。携带镰状细胞贫血症基因的杂合体对疟疾有很小但很重要的抗性。2.3免疫球蛋白（immunoglobulin）l 免

41、疫球蛋白G（IgG）是主要的抗体分子。IgG有4条肽链，2条重链2条轻链，通过4个二硫键连接形成Y状复合物。重链、轻链、恒定结构域和可变结构域的图参考Lehninger P194。l 抗体（antibody）结合的专一性是由可变区的序列决定的。专一性指抗原（antigen）与其专一结合部位之间在形状、电荷、非极性以及氢键分布方面是互补的。l 抗体-抗原的结合非常强，Kd为1010。l 相对分子量小于5000的分子通常无抗原性，但小分子与大分子蛋白共价结合，则可以引起免疫反应。l 一种效应B淋巴细胞只分泌针对一种抗原决定簇的抗体。多种抗原决定簇刺激机体使之特异性产生多种效应B细胞制备的抗体称多克

42、隆抗体（polyclonal antibody）。一种抗原决定簇刺激机体使之特异性产生一种效应B细胞制备的抗体称单克隆抗体（monoclonal antibody）。2.4肌球蛋白（myosin）和肌动蛋白（actin）l 肌肉收缩力由肌动蛋白和肌球蛋白相互作用产生。l 肌球蛋白由2条重链4条轻链组成。羧基端（尾部）是两条重链形成螺旋（左旋）。氨基端（头部）每条重链有一个球状的头（S1），含有ATP水解部位。轻链结合在重链头部。l 肌球蛋白棒状尾部相连（连接处形成肌原纤维的M line），聚集形成粗丝（thick filament）。l 肌动蛋白几乎在所有的真核细胞中含量都很丰富。l 肌肉中的

43、单体肌动蛋白称G-肌动蛋白（globular actin），上面结合有ATP，聚合，形成F-肌动蛋白（filamentous actin）；ATP水解为ADP，为F-actin、肌钙蛋白和原肌球蛋白构成细丝（thin filament）提供能量。第四节.酶1 概述l 绝大多数酶（enzyme）是蛋白质。l 一些酶需要辅因子（cofactor）的参与才能发挥作用。辅因子可以是无机金属离子，或称为辅酶（coenzyme）的有机分子与有机金属分子。l 有些辅因子与蛋白质结合非常紧密（共价或非共价结合），称为辅基（prosthetic group）。l 脱辅基酶（apoenzyme），又称脱辅基蛋白（

44、apoprotein），结合上辅因子称为全酶（holoenzyme）。l 维生素（vitamin）可以作为辅酶的前体。l 根据酶所催化的反应类型，可以把酶分为6大类，分别为：氧化还原酶（转移电子）、转移酶（转移基团）、水解酶（水解）、裂解酶（生成双键）、异构酶（生成异构体）、合成酶（成一些共价键）l 酶促反应的特点是：高效、专一、条件温和。2酶作用机制l 酶影响反应速率，不改变反应平衡。l 酶通过降低反应的活化能（activation energy）提高反应速率。l 酶与底物（substrate）的最佳相互作用发生在过渡态（transition state）而不是ES态。此时，酶与底物存在弱的

45、相互作用，释放出结合能（binding energy）。结合能能够抵消部分过渡态的能量升高，即净降低了活化能，提高反应速率。l 酶与底物之间的弱的相互作用（包括离子键、氢键等）是酶催化的一个主要动力。弱的相互作用可以距离反应部位很远。由于酶促反应需要多种弱的相互作用力来驱动，因此酶（以及一些辅酶）一般较大，才能提供足够的功能基团，并精确定向，提供结合能。l 结合能可以用于克服以下能障：熵降（entropy reduction）、去溶剂化（desolvation）、电子重排（electron redistribution）、诱导酶构象改变（conformation change）。l 酶和过渡态

46、的最佳相互作用也是酶促反应专一性的体现。只有特定的结合才能产生足够的结合能。l 酶促反应的过渡态理论有理论依据，包括底物过渡态类似物对酶的结合力比正常底物高出102106倍。l 根据催化机制可以分为酸-碱催化（acid-base catalysis）、共价催化（covalent catalysis）和金属离子催化（metal ion catalysis）。l 酸-碱催化分为狭义（specific）酸-碱催化和广义（general）酸-碱催化两种。为稳定带电的中间体，必须有其它质子供体或受体。前者的质子供体/受体是水（H3O、OH），后者是其它类型的分子。酶活性中心的AAs作为质子供体或受体，使

47、带电中间体电子转移的速度大于中间体分解为反应物，从而催化反应。l 共价催化是指酶的AAs侧链或辅因子作为一个亲核基团，进攻底物使其键断裂，并形成酶-底物共价复合物，再进一步反应得到产物。这个过程的活化能低于非酶促反应的活化能。l 金属离子催化是指结合金属离子的酶与底物间的离子相互作用指导底物反应，或稳定带电荷的过渡态，还可以通过可逆的氧化态变化介导氧-还反应。3酶促反应动力学（enzyme kinetics）3.1酶动力方程l 酶与过量底物混合时，会有一个前稳态（pre-steady state），这个阶段ES浓度逐渐升高。然而前稳态是非常快且难以观察的一个过程，很快就进入稳态（steady

48、state），此时ES及其它中间体的浓度近乎恒定（即ES生成速度与ES分解为E、P的速率相当）。l 米氏方程（Michaelis-Menten equation）：。其中，Km（Michaelis常数）等于初速度达到最大速度一半时底物的浓度。l 最大速度即所有酶均达到饱和状态时的速度。l 利用双倒数作图法可以求出Km。Vmax和Km可以通过实验测得，但并不能反映一个连续反应步骤的数目、速度和化学本质。l Km有时可以近似表示酶和底物的亲和力。l 对于多步反应来说，如果出现了一个明显的限速步骤，那么引入一个kcat来表示此步骤的速度常数。kcat也称为转换数（turnover number），它

49、的定义是当酶被底物饱和时，单位时间内一个酶分子转化底物的分子数。l 专一性常数kcat/Km是一个二级速度常数，单位为M1s1。它有上限，取决于E和S在一定液体环境中的扩散速度。大多数酶在108109之间。l 前稳态中，许多反应步骤的速率可以单独测得出来。3.2酶抑制（inhibition）机制l 酶的抑制分为可逆（reversible）抑制和不可逆（irreversible）抑制两种。可逆抑制又分为竞争性（competitive）抑制、反竞争（uncompetitive）抑制和混合性（mixed）抑制。l 竞争性抑制是抑制剂与底物竞争酶的活性部位，形成EI。竞争性抑制剂通常是一些与底物类似的

50、化合物。即使这种结合是短暂的，也会降低效率。正因为竞争性抑制剂是与酶可逆结合的，因此通过增大底物浓度，可以降低抑制效果。（底物与酶结合的几率大大提高）。竞争性抑制的Km增大而Vmax不变，它只影响V0（使降低，抑制剂浓度越高，V0越小，1/V0越大，直线越陡）而不影响Vmax。l 反竞争抑制是抑制剂与酶活性部位以外的部位结合，且只与ES态的结合。反竞争抑制剂浓度越高，Vmax越小（此时表观Km也越小），1/Vmax越大，则截距越大，直线越向左平行移动。l 混合性抑制剂也是与酶活性部位以外的部位结合，不过它既与E结合，也与ES结合。通常既影响Km又影响Vmax。抑制剂的浓度越大，曲线越陡，截距越

51、大。l 混合性抑制的特例是非竞争性（noncompetitive）抑制。它只影响Vmax不影响Km。l 反竞争抑制和混合性抑制只发生在双底物或多底物酶上。l 不可逆抑制剂（又称inactivator，意为灭活剂、钝化剂）结合或破坏酶催化所必需的功能基团，或与之形成紧密的非共价结合。常见的类型是与酶形成共价连接。l 基团特异性（group-specific）灭活剂特异性地与AAs的R基结合影响酶的活性。亲和（affinity）灭活剂和底物的结构相似，能够共价修饰酶活性部位。自杀性（suicide）灭活剂（又称基于机制的抑制剂，mechanism-based inactivator）能完成正常酶促

52、反应的前几步但不转化为产物，而是形成一种活泼化合物不可逆地与酶结合。l 酶有各自的最适pH、温度。3.3双底物动力学l 每一个底物都有其特征Km。反应机制有形成三元复合物（ternary complex）和不形成三元复合物两种。l 在形成三元复合物的酶促反应中，酶和两种底物一起形成三元复合物，分为随机型（random order）和有序型（orderd）两种。随机型是指两种底物与酶的结合不分先后顺和有序型，有序型则是有先后顺序的。作出来的曲线就像是混合性抑制的曲线。（把S1看成是抑制剂，它既结合E又结合ES2，不过增大S1，速度是越快，曲线越平，截距越小，刚好是倒过来的）l 不形成三元复合物的

53、酶促反应又称乒乓机制或双置换机制（double displacement mechanism）。S1先与E结合，生成P1并使酶变性成E，然后E再与S2结合，生成P2，E恢复为E。作出来的曲线就像是反竞争抑制的曲线。（不过增加S2会提高速度，刚好相反）4酶促反应的例子l 胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）特异地切割与芳香性AAs（Trp、Tyr、Phe，有时会切Met）相邻的肽键。属于丝氨酸蛋白酶家族（serine protease family）。该家族还有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、血纤维蛋白溶酶等。该家族都拥有一个催化三分子（catalytic triad），Ser

54、是一个强的亲核试剂。它们的专一性是由底物结合袋（substrate binding pocket）决定的。l 其它的蛋白水解酶家族还有天冬氨酸蛋白水解酶家族、胱氨酸蛋白水解酶家族、金属蛋白水解酶家族等。l 胰凝乳蛋白酶的催化反应支持了过渡态稳定的原理（Gly193和Ser195的氨基N通过形成氢键的方式稳定了中间体负电荷），也是一个广义酸碱催化和共价催化的例子。5调节酶（regulatory enzyme）+l 酶活性的调节可以通过变构调节（可逆、非共价）、共价调节（可逆）、水解（不可逆）、基因调节（改变特定酶的数量）实现。l 调节酶（连锁反应的第一个酶往往是调节酶，限速的步骤）有一类是别构酶

55、（allosteric enzyme），它可逆地与别构调节剂（allosteric modulator，通常是小分子代谢物或辅助因子）非共价结合，触发构象变化并转导到活性部位（分子内的信号转导）。l 别构调节剂可以是正调节物（激活剂；往往是酶的底物，此时调节酶称为同促酶）也可以是负调节物（此时酶称为异促酶）。l 别构酶除了活性部位之外，还有一个或更多的调节物结合部位或者别构部位，专一性地与调节物结合。对于同促酶，催化部位和调节部位是相同的。l 别构酶通常比非别构酶大，为多亚基蛋白。l 反馈抑制（feedback inhibition）属于异促别构调节。l 别构酶的动力学特征有别与米氏行为。l 磷酸化是目前已知的最主要的可逆共价（covalent）调节。蛋白质的磷酸化（phosphorylation）由激酶（protein kinase）催化。酶的磷酸化能稳定酶的构象，改变酶和底物的亲和力。磷酸化往往是多层次的。l 酶的前体称为酶原（zymogen