从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究

1、从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺讨论1533202111-0066-05Study on the process of chitin extraction from Aspergillus mycelium*YU Ying1*， LI Li2， RONG Shaofeng2， GUAN Shimin2*1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 202113， China； 2. Shanghai Institute of Technology， Shanghai 202118， ChinaABS

2、TRACT Objective： To study a process of chitin extraction from mycelia of Aspergillus ochraceus. Methods： Using Aspergillus mycelium as raw material， the conditions for acid and alkali treatment were optimized by single factor test and the extraction process was finally obtained. Results： Mycelia wer

3、e soaked for 12 hours under the condition of solid-liquid ratio 1：20， 1 mol/L HCl at 10 for 12 h to remove mineral substances； socking with 2 mol/L NaOH at 20 for 5 h under the condition of solid-liquid ratio 1：20， repeat 3 times. The resultant chitin was with 0.89% of ash content， 0.74% of residual

4、 protein， the yield was 41.15%. Conclusion： The chitin prepared by the extraction process has high yield， low ash and impurity protein content， and its quality， color and residual ash are superior to that extracted from shrimp and crab shell， and the extraction process is relatively environmentally

5、friendly， and is suitable for industrial production.KEY WORDS Aspergillus； fermentation； extraction technology； chitin甲殼素chitin又名几丁质、甲壳质，是一种广泛存在于自然界的自然高分子聚合物，主要存在于节肢动物如虾、蟹的外壳和真菌及一些藻类植物的细胞壁中1。目前商品化的甲壳素主要为虾、蟹壳提取制得，经过脱矿物质、脱蛋白和脱色处理2。微生物发酵法提取制备甲壳素是以菌丝体为原料接受酸碱交替法提取制得。与自虾、蟹中提取甲壳素相比，微生物发酵法有如下优势3：简洁发酵即可获得甲壳素

6、，不受原料来源地域、时间的局限；利用稀酸、稀碱即可提取，工艺相对环保；菌丝体无机物含量较低，无需矿化等繁琐步骤；无虾、蟹来源的蛋白等过敏原；易工业化大规模生产。因此，真菌发酵生产甲壳素/壳聚糖极具应用前景，尽管有大量关于真菌发酵制备甲壳素的讨论，但是其工业化应用鲜有报道4-5。此外，甲壳素脱乙酰产物壳聚糖和其酶解产物壳寡糖因生物活性更高，作为生物材料在医疗领域更具应用价值6-9。1 材料与方法1.1 材料赭曲霉MF010保藏号CGMCCNo.15668由上海应用技术大学微生物试验室提供；甲壳素对比品上海昊海生物科技股份有限公司，BR级；NaOH 永华化学科技江苏有限公司，分析纯；HCl上海泰坦

7、科技有限公司，分析纯。MSA-0420搅拌机上海沉汇仪器有限公司；DHP-9272电热恒温鼓风枯燥箱上海一恒科技有限公司；HH-1电热恒温水浴锅北京长源试验设备厂；BS210S电子分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DJ-04粉碎机上海隆拓仪器设备有限公司；SJL-1400马弗炉上海倨晶周密仪器有限公司；PH-3C pH计雷磁上海有限公司；HYG-3C恒温摇床太仓市豪老实验仪器制造有限公司；SKD-800自动凯氏定氮仪上海沛欧分析仪器有限公司。 1.2 试验方法1.2.1 发酵方法斜面培育：将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下转接于斜面培育基中，于恒温恒湿培育箱中26 培育5 d。种子培育：将斜面菌

8、种于无菌操作下，刮取孢子并转移至无菌生理盐水中悬浮，根据10%接种量转接于种子培育基中，在恒温摇床中26 ，180 r/min培育24 h。发酵培育：将获得的种子培育液，于无菌操作下根据10%的接种量转接于发酵培育基中，在恒温摇床中26，180 r/min培育40 h。1.2.2 甲壳素提取菌体破壁处理：发酵液抽滤取滤渣，根据质量体积比，加入菌体湿重3倍的HCl溶液质量分数为1.8%，搅拌破壁处理1 h，用NaOH溶液调整pH至6.0，抽滤取滤渣，用纯化水清洗滤渣至中性。滤渣用无水乙醇脱水2次后，置于烘箱中45 烘干至恒重，获得干菌丝体。酸处理：比较酸浓度、酸处理时间、酸处理温度和固液比对灰分

9、去除和蛋白质含量的影响10。碱处理：比较碱浓度、碱处理温度、碱处理时间、固液比对蛋白质去除和收率的影响10。1.3 检测方法灰分测定：参照中华RM共和国药典灰分测定法测定11。蛋白质含量测定：参照中华RM共和国药典凯氏定氮法测定11附录88-89。2 结果2.1 酸处理2.1.1 酸浓度对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响HCl濃度在0.01.0 mol/L时，随着HCl浓度的增加灰分含量渐渐下降，脱除无机盐效果明显，灰分从初始的3.41%降低至1.45%，蛋白质含量由25.34%降低至16.32%，菌体收率为71.31%；HCl浓度超过1.0 mol/L后，其灰分含量下降趋势不明显，当HCl浓

10、度增加到5.0 mol/L时，灰分含量为0.76%，蛋白质含量为15.87%，菌体收率为53.85%。在实际操作中，HCl浓度过高会使反应速率过快而不易操纵，且随着HCl浓度的增加甲壳素易于水解，因此，HCl浓度为1.0 mol/L较合适图1。2.1.2 酸处理时间对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响反应时间在012 h，随着酸浸泡时间的增加，灰分含量急剧下降，由3.41%降低至0.96%，蛋白质含量由25.34%降低至15.99%，菌体收率由100%降低至64.81%，脱除无机盐效果明显。当反应时间超过12 h，其灰分含量、蛋白质含量以及菌体收率下降趋势减缓；17 h以后，HCl与钙盐的反应基

11、本到达平衡，再延长时间对脱除无机盐效果的影响不大，但菌体收率却降低许多，因此，选择酸处理时间12 h更为合适图1。2.1.3 酸处理温度对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响随着反应温度的升高，无机盐脱除效果越好，灰分显著降低。当反应温度在-1010 时，随着温度的升高，脱除无机盐的效果较好，灰分由3.41%降低至0.98%，菌体收率由100%降低至67.51%，蛋白质含量由25.34%降低至16.35%。当反应温度高于10 时，随着温度的升高，灰分含量及蛋白质含量下降缓慢，菌体收率由67.51%降低至32.27%，且菌丝体颜色变深且不易除去。考虑本钱、菌体收率及脱除无机盐效果等因素，酸处理温度操

12、纵在10 较为合适图1。2.1.4 酸处理固液比对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响随着固液比的增高，灰分含量、蛋白质含量及菌体收率均有不同程度的下降。当固液比到达110，菌体总蛋白质含量下降至15.98%，继续增高固液比不能使蛋白质含量继续大幅降低。当固液比为110，120时，灰分含量分别为0.96%，0.67%，继续增高固液比，灰分含量下降不明显。随着固液比增高，菌体收率下降幅度明显，当固液比为110，120时，菌体收率分别为67%，65%，当固液比继续增高，收率下降幅度加大，当固液比为150时，菌体收率仅为38%图1。总体来看，在保证菌体收率尽可能高的前提下，固液比为120，蛋白质及灰分去

13、除效果最好。因此，最正确固液比为120。2.2 碱处理2.2.1 碱浓度对蛋白质去除和收率的影响随着NaOH浓度的提高，蛋白质去除的效果越好。当NaOH浓度为2 mol/L时，蛋白质含量为3.48%，菌体收率为49.54%，灰分含量为1.03%，当NaOH浓度为5 mol/L时，蛋白质含量为2.97%，菌体收率为45.39%，灰分含量为1.39%，对蛋白质去除的影响效果不大，且随着NaOH浓度的增加，易使几丁质脱乙酰化生成壳聚糖，因此，选择浓度为2 mol/L的NaOH溶液碱处理图2。2.2.2 碱处理时间对蛋白质去除和收率的影响在反应的初始阶段，随着碱处理时间的延长，蛋白质含量急剧下降，蛋白

14、去除效果明显，反应5 h后，蛋白含量从19.95%降低为3.75%，灰分含量由0.56%增加为0.84%，而菌体收率由63.92%降低为50.58%；碱处理时间在514 h，蛋白质含量下降趋势减缓，由3.49%降低为0.68%，而灰分含量由0.84%增加为1.20%，菌体收率损失较大，由50.58%降低为35.28%。一般来说，蛋白质去除时间越长水解越彻底，考虑到长时间反应会带来生产本钱上的增加，因此，选择碱处理时间5 h为宜图2。2.2.3 碱处理固液比对蛋白质去除和收率的影响从理论来说，固液比越大，蛋白质去除的效果越好。当固液比从10增加到120时，蛋白质含量由19.95%降低为3.58%

15、，灰分含量从0.56%升高为0.85%，菌体收率从63.92%降低为43.97%。当固液比120增加到150时，蛋白质含量由3.58%降低为1.32%，灰分升高了0.42%，菌体收率由43.97%降低为30.02%，即当固液比大于120时，对蛋白质的去除影响不大，且菌体收率损失较大，废水排放量增多，所以选择固液比120为宜图2。 2.2.4 碱处理温度对蛋白质去除和收率的影响随着碱处理温度的升高，蛋白质含量略有下降，当温度为20 时，蛋白含量降低为1.56%，灰分含量增加为1.06%，菌体收率降低为47.71%；当温度继续升高时，蛋白质去除效果不明显，温度从20 增加到80 时，蛋白含量由1.

16、56%降低为1.08%，灰分含量由1.06%增加为1.36%，而菌体收率却由47.71%降低为32.10%，菌体收率损失较大。温度对NaOH水解蛋白质影响较大，在其它条件固定的状况下，反应温度越高，蛋白质碱水解的速度越快；但温度到达20 时，蛋白质的碱水解反应趋于平衡，继续升温对蛋白质去除的效果不明显。因此，选择碱处理温度20 为宜图2。2.2.5 碱处理次数对蛋白质去除和菌体收率的影响随着碱处理次数的增加，蛋白质、灰分及菌体收率均有所下降。碱处理2次，灰分含量为0.92%、蛋白含量为0.94%、收率为42.73%。碱处理3次，灰分含量为0.98%、蛋白含量为0.64%、收率为41.15%。3次碱处理虽然会降低最终收率，但蛋白质含量可以降低至1.0%以下，所以，选择3次碱处理为宜图2。2.3 最正确工艺的试验结果确定甲壳素提取的最正确工艺条件：HCI浓度为1.0 mol/L，固液比120，處理温度10 ，浸泡时间12 h；然后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；NaOH浓度为2.0 mol/L，固液比120，处理温度20 ，浸泡时间5 h，连续处理3次。处理后的菌体粉末于45烘箱烘干2 h，得到的白色粉末即为甲壳素。在以上工艺条件下展开3次平行试验的结果如