产品中大肠埃希菌的检测

1、产品中大肠埃希菌的检测1实验目的：检测产品中的大肠埃希菌2实验步骤2.1 仪器恒温培养箱（3035C）、生化培养箱（23-28C）、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱（250300C）、电冰箱、366nm紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。电子天平或天平（感量0.1g）,pH系列比色计。锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。无菌氯化钠溶液、无菌氯化钠一蛋白月东缓冲液、无菌聚山梨酯80、大肠埃希菌、靛基质、接种环、结晶紫、碘液、95温醇、沙黄染液培养基：营养肉汤、营养琼

2、脂、胆盐乳糖（BL）培养基、MU箔养基、EMB2.1.1 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g,加水溶解至1000mL121c灭菌20min。2.1.2 pH7.0无菌氯化钠一蛋白月东缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g,磷酸氢二钠7.23g,氯化钠4.30g,蛋白月东1.0g,加水1000mL微温溶解，分装，过滤，灭菌。2.1.3 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液：取吐温801mL加0.9%ft化钠溶液至100mL121c灭菌20min2.1.4 靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛10.0g,加入戊醇150g,充分振摇，完全溶解后，取浓盐酸50mL徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保

3、存，备用。2.1.5 沙黄染液：取沙黄0.25g,力口95%的乙醇10mL使完全溶解后，加水至100mL2.1.6 结晶紫染液：取结晶紫1.0g,加95%的乙醇20mL使溶解，加1%勺草酸镂溶液80mL混匀。静置#23使用，置密闭棕色瓶中储存。2.1.7 碘试液：取碘化钾2.0g，加水3-5mL溶解，加入碘片1.0g,全部溶解后，加水稀释至300mL置密闭棕色瓶中储存。2.1.8 营养肉汤培养基：蛋白月东10g,牛肉浸出粉3g,氯化钠5g,水1000mL取上述成分，混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.20.2,灭菌。2.1.9 营养琼脂培养基的制备：牛肉膏3

4、g蛋白月东10gNaCl5g琼月旨15-17g蒸储水1000mLpH7.4将除琼脂以外的各成分溶解于水中，以1moL/LNaOH溶液校正pH7.4,分装三角瓶，而后按培养基的量加入1.5%-1.7%琼脂，0.1Mpa灭菌20min后倒平板备用。2.1.10 胆盐乳糖培养基（BL）:蛋白月东20g,乳糖5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾（&HPQ1g,磷酸二氢钾（KHPO）1.3g,牛胆盐（或去氧胆酸钠0.25g）1.3g,水1000mL除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热溶解后，调节pH使灭菌后为7.20.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。2.1.11 4一甲基伞形酮葡萄糖甘酸蛋白月

5、东培养基（MUG：蛋白月东10g,氯化钙50mg硫酸镒0.5mg,硫酸锌0.5mg,硫酸镁0.1g,氯化钠10g,磷酸二氢钾（无水KHPO）0.9g,磷酸氢二钠（无水NaHPQ,亚硫酸钠40mg去氧月!酸钠1g,4一甲基伞形酮葡萄糖甘酸75mg水1000mL除4一甲基伞形酮葡萄糖甘酸外，上述各成分溶解于1000mL水中，调节pH使灭菌后为7.30.1，加入4一甲基伞形酮葡萄糖甘酸，溶解后，每管分装5mL115C,灭菌20min。2.1.12 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB：营养琼脂培养基100mL20%L糖溶液5mL曙红钠指示液2mL亚甲蓝指示液1.31.6mL取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至

6、60C,按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液，摇匀，倾注平皿。2.1.13 曙红钠指示液：取曙红钠2.0g,加水溶解成100mL2.1.14 亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g,加水溶解成100mL2.2 对照用菌液的制备：取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5mL营养肉汤培养基内，置36c1C,培养1824h,取均匀培养物1mL用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1mL含菌10100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。2.3 供试液的制备：取供试品10g,力DpH7.0无菌氯化钠一蛋白月东缓冲液至1000mL用匀浆仪(30005000r/min2

7、-4min)或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。2.4 阳性对照试验各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu,供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的各控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。2.5 阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml(或200ml)相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。2.6 检验程序瞅岫扁哪嘏触In她附解r崎fBL糊麴Lem瞰1型部轿则鞋电池产加加鞭嬲惆体协C傩J肃摊2.6.1 增菌培养

8、取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液（相当于供试品1g、1ml、10cm）,另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18-24小时，必要时可延至48小时。阴性对照应无菌生长。取上述培养物0.2ml,接种至含5mlMU能养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MU箔养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG日性；不呈现荧光，为MUG1性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MU0口靛基质试验应为阴性。如MUG日性、靛基质阳性，判供试

9、品检出大肠埃希菌；如MU瑚性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。2.6.2 分离培养如呈现MUG日性、靛基质阴性或MUGm生、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养液划线于;EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18-24h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红业甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿

10、润当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EM限麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。2.6.3 纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2-3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18-24h,作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EM琳脂平板，培养18-24h,再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。2.6.4 革兰染色、镜检以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。滴加结晶紫染液，染色1min,水洗。滴加碘液，媒染1min,水洗，以滤纸吸干余水。滴加95温醇，脱色20-30S,水洗。滴加沙黄染液，复染1min,待干后，镜检。染色结果判定：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，