(5) 离心技术

1、离心技术离心技术1离离 心心 技技 术术 离心是利用旋转运动的离心力，以离心是利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作技进行分离、浓缩和提纯的一项操作技术。术。2主主 要要 内内 容容3一、离心的基本原理一、离心的基本原理利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮力密度差的物质分离开。力密度差的物质分离开。4离心力离心力离心力（离心力（F）：当离心机转子以一定的角速度）：当离心机转子以一定的角

2、速度（弧度（弧度/秒）旋转，秒）旋转，颗粒的旋转半径为颗粒的旋转半径为r（厘米）时，颗粒所受的向外的力即离心力。（厘米）时，颗粒所受的向外的力即离心力。52Fmamr: : 旋转角速度旋转角速度 r r：旋转体离旋转轴的距离：旋转体离旋转轴的距离2/sec60nrad相对离心力（相对离心力（RCFRCF）：又称分离因数，是衡量离心程度的）：又称分离因数，是衡量离心程度的参数，参数，是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数，单位是重力加速度球引力的倍数，单位是重力加速度g g（980cm/980cm/秒秒2 2）。）。RCF=RCF=2

3、 2r/980 = 4r/980 = 42 2n n2 2r/3600r/3600* *980 = 1.119980 = 1.119* *1010-5-5n n2 2r r低速离心时常以每分钟的转数低速离心时常以每分钟的转数rpm（即（即n）来作为离心力单）来作为离心力单位；而高速离心则以位；而高速离心则以g表示。表示。2225241.119 109803600 980rn rRCFn rn n：转子每分钟的转数（：转子每分钟的转数（rpmrpm）6半径半径相对离心力相对离心力转数转数7沉降系数沉降系数 Sedimentation coefficient (S) 离心沉降和重力沉降只是对沉降的

4、作用力不同，离心沉降离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，离心沉降的速度的速度v 其中其中S即为沉降系数。即为沉降系数。 S表示单位离心场中粒子的移动速度。表示单位离心场中粒子的移动速度。 r1:离心前粒子距离转轴的距离离心前粒子距离转轴的距离 r2:离心后粒子距离转轴的距离离心后粒子距离转轴的距离82vSr212221loglog2.303()rrvSrtt沉降速度单位离心力 S S在实际应用时常在在实际应用时常在1010-13-13秒左右，故把秒左右，故把沉降系数沉降系数1010-13-13秒称为一个秒称为一个SvedbergSvedberg单位，单位，简写简写S S，量纲为秒。，量纲

5、为秒。9 样品颗粒的大小样品颗粒的大小 形状形状 密度密度 溶剂的粘度、密度溶剂的粘度、密度 离心加速度离心加速度1011沉降速度沉降速度 sedimentation velocity(1)(1)定义：定义： 指在强大的离心作用下，单位时间内物指在强大的离心作用下，单位时间内物质运动的距离。质运动的距离。2222()218pmdrdxvxxdtpm（-）9 r r： 球形粒子的半径球形粒子的半径 d d： 球形粒子的直径球形粒子的直径： 流体介质的粘度流体介质的粘度 p p：粒子的密度：粒子的密度m m：介质的密度：介质的密度1213沉降时间沉降时间(Sedimentation Time, T

6、s)(Sedimentation Time, Ts)22/vdx dtSxx21dxdtSx21212ln/1sxxTttS公式变换得公式变换得上式积分得上式积分得X X2 2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离为离心转轴中心至离心管底内壁的距离; ;X X1 1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离；为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离；TsTs以小时为单位以小时为单位,S,S以以SvedbergSvedberg为单位。为单位。1415 分类标准多种多样：分类标准多种多样：（一）根据转速分类：低速、高速、超速（一）根据转速分类：低速、高速、超速16项目项目低速离心机低速离心机高速离心机高速离心机

7、超速离心机超速离心机转数(rpm)2000-600010000-2600030000-120000离心力(rcf)2000-7000g8000-80000g100000-6000000g适用范围细胞适用适用适用细胞核适用适用适用细胞器-适用适用蛋白质-适用1 1. .低速离心机低速离心机 (2000-6000rpm) 转子转子 电动机电动机 转子带有放置离心管的孔转子带有放置离心管的孔转子的中央位于离心机的驱动轴上转子的中央位于离心机的驱动轴上离心机的转速和温度控制不够准确离心机的转速和温度控制不够准确 一般最高转速在一般最高转速在6,000rpm6,000rpm以下以下实验室中常用于分离制备

8、。实验室中常用于分离制备。 17 2.2.高速离心机高速离心机 (10000-26000rpm)(10000-26000rpm) 制冷设备温度控制在制冷设备温度控制在0-40-4范围内范围内 制动器（刹车）制动器（刹车） 实际速度和温度可通过仪表显示实际速度和温度可通过仪表显示 配有一定类型及规格的转子配有一定类型及规格的转子 最高转速在最高转速在26,000rpm26,000rpm以下以下 常用于生物大分子的分离制备常用于生物大分子的分离制备 183.3.超速离心机超速离心机 驱动和速度控制驱动和速度控制 温度控制温度控制 真空系统真空系统 转子转子常用于分离亚细胞器、病毒粒子、常用于分离亚

9、细胞器、病毒粒子、DNADNA、RNARNA和蛋白质分子。和蛋白质分子。在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。1920（二）（二）. .根据转子形式分类根据转子形式分类(Rotor)(Rotor) 固定角式转子固定角式转子(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor) 水平转子水平转子(swing-out rotor)(swing-out rotor) 垂直转子垂直转子(vertical rotor)(vertical rotor) 带状转子带状转子(zonal rotor)(zonal rotor)

10、连续转子连续转子(continuous rotor) (continuous rotor) 转子的材质：转子的材质：铝质铝质 较轻较轻, ,耐受强度较弱耐受强度较弱, ,适合在较低适合在较低 的转速下使用的转速下使用; ;不锈钢不锈钢 耐受强度最好耐受强度最好, ,但材质本身太重；但材质本身太重； 钛合金钛合金 耐受强度不错耐受强度不错, ,重量也比不锈钢轻。重量也比不锈钢轻。 2122 常见的角度常见的角度 2020 28 28 34 34 40 40 沉降界面沉降界面沉淀沉淀232425角式转子的特点：角式转子的特点： （1 1）重心低重心低, ,转速可较高；转速可较高； （2 2）样品粒

11、子穿过溶剂层的距离略大于）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于 离心管的直径离心管的直径; ; （3 3）“管壁效应管壁效应” ： 有一定的角度有一定的角度, , 在离心过程中撞到在离心过程中撞到 离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形 成沉淀成沉淀, , 此效应使最后在管底聚成的沉此效应使最后在管底聚成的沉 淀较紧密。淀较紧密。 26521.119 10RCFn rR1R2R3272.2.水平转子水平转子 （1 1）转子静止时）转子静止时, ,处在转子中的离心管中处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行心线与旋转轴平行, ,（2 2）转子旋转加速时）转子旋转加速时, ,

12、离心管中心线由平离心管中心线由平 行位置逐渐过渡到垂直位置行位置逐渐过渡到垂直位置, ,即与旋即与旋 转轴成转轴成9090角角, ,（3 3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致，有少量的一致，有少量的“管壁效应管壁效应”。 2829303.3.垂直转子垂直转子 离心管垂直插入转子孔内离心管垂直插入转子孔内, ,在离心过程在离心过程中始终与旋转轴平行中始终与旋转轴平行, ,而离心时而离心时液层液层发生发生9090角的变化角的变化, ,从开始的水平方向改成垂直从开始的水平方向改成垂直方向方向, ,当转子降速时当转子降速时, ,垂直分布的液层又逐渐垂直分布的液层

13、又逐渐趋向水平趋向水平, ,待旋转停止后待旋转停止后, ,液面又完全恢复成液面又完全恢复成水平方向。水平方向。31区带转头的样品及介质与转头直接接触，要求转子耐腐蚀，区带转头的样品及介质与转头直接接触，要求转子耐腐蚀，并且操作复杂。并且操作复杂。缺点缺点：323334自动排出沉渣的离心澄清机自动排出沉渣的离心澄清机35分批自动排出沉渣的离心澄清机分批自动排出沉渣的离心澄清机36（三）根据用途分类：（三）根据用途分类：实验室或工厂、分析或制备实验室或工厂、分析或制备37（四）根据离心形式分类：（四）根据离心形式分类：离心离心过滤过滤：指在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮：指在有孔转鼓的离心

14、机中通过过滤介质分离悬浮液的过程。液的过程。离心离心沉降沉降：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或离：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或离心管中进行悬浮液沉降的过程。心管中进行悬浮液沉降的过程。离心离心分离分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分离不同比重的液体的过程。离不同比重的液体的过程。38（五）根据结构特点分类：（五）根据结构特点分类：转子形状：角式、外摆、管式、碟片式转子形状：角式、外摆、管式、碟片式转轴位置：直立、水平、倾斜转轴位置：直立、水平、倾斜驱动方式：手摇、气动、磁悬、驱动方式：手摇、气动、磁悬、电动电动39操作

15、方式：连续、半连续、间歇操作方式：连续、半连续、间歇卸料方法：人工、重力、刮刀、振动、蠕动卸料方法：人工、重力、刮刀、振动、蠕动泵、喷嘴、螺旋等泵、喷嘴、螺旋等使用温度：冷冻和常温使用温度：冷冻和常温40三三. .离心分离方法离心分离方法 根据离心原理根据离心原理, ,按照实际工作的需要，目按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分三类分三类41421.1.平衡离心法平衡离心法 根据粒子大小、形状不同进行分离。根据粒子大小、形状不同进行分离。 差速离心法差速离心法(differential velocity centrifugati

16、on)(differential velocity centrifugation) 速率区带离心法速率区带离心法(rate zonal centrifugation)(rate zonal centrifugation)。43( (一一).).差速离心法差速离心法1 1、原理原理 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别, ,在同一离在同一离心条件下心条件下, ,沉降速度不同沉降速度不同, ,通过不断增加相对离心力通过不断增加相对离心力, ,使一使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。 44 例用差速离

17、心法分离已破碎的细胞各组份例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞已破碎的细胞 500g,10500g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (细胞核）细胞核） 10,000g,1010,000g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (细胞膜碎片细胞膜碎片, ,线粒体线粒体,) 100,000g,3,) 100,000g,3小时小时 溶酶体溶酶体 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (核糖核蛋白体）核糖核蛋白体） ( (可溶性成份可溶性成份) ) 45( (二二).).速率区带离心法速率区带离心法1 1. .原理原理 离心前离心管内先离心前离心管内先装入密度梯度介质装入密度梯度介质

18、, ,形成密度梯度形成密度梯度，介，介质最大密度要小于所有样品颗粒的密度。样品铺放在梯度溶液质最大密度要小于所有样品颗粒的密度。样品铺放在梯度溶液表面，离心后不同大小、形状，有一定沉降系数差异的颗粒形表面，离心后不同大小、形状，有一定沉降系数差异的颗粒形成若干条界面清楚的不连续区带。成若干条界面清楚的不连续区带。46( (三三).).等密度离心法等密度离心法1 1原理原理 预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合顶上或混合, ,离心开始后离心开始后, , 梯度液受离心力的作用逐

19、渐形成底浓而管顶稀的密度梯度梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度, ,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。472 2. .注意点注意点：离心时间要长离心时间要长可用角式转头或水平式转头可用角式转头或水平式转头粒子密度相近或相等时不宜用粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用刹车不能用刹车48分离法分离法速度区带离心法速度区带离心法平衡密度梯度离心法平衡密度梯度离心

20、法原理原理沉降与颗粒质量成正比，以沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分物质沉降速度的不同进行分离离沉降与颗粒的密度成正比，以物质沉降与颗粒的密度成正比，以物质的浮密度不同进行分离的浮密度不同进行分离介质介质密度小，如蔗糖、甘油、聚密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓度蔗糖，蔗糖浓度10% 67%，密，密度度11.3286预制梯度，不连预制梯度，不连续续密度大，如密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl浓度浓度01355，密度为，密度为11.9025，自成，自成连续梯度连续梯度离心力场离心力场强，离心速度高，使被分离强，离心速度高，使被分离物质易沉降物质易沉降稍强，速度相对低，使稍

21、强，速度相对低，使CsCl形成梯形成梯度，建立沉降扩散平衡度，建立沉降扩散平衡离心过程离心过程样品向离心管底沉降样品向离心管底沉降不论样品起始时在什么位置，离心不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介质的等密度部位中样品停留于介质的等密度部位离心时间离心时间较短，一般为几小时到几十较短，一般为几小时到几十小时小时较长，十几小时到数天较长，十几小时到数天49密度梯度离心操作步骤密度梯度离心操作步骤505152常用的梯度材料：常用的梯度材料：糖类糖类: : 蔗糖、甘油、聚蔗糖蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)(Ficoll)、右糖酐、糖原、右糖酐、糖原 无机盐类无机盐类:CsCl(:CsCl(

22、氯化铯氯化铯) )、RbCl(RbCl(氯化铷氯化铷) )、NaClNaCl、KBrKBr等等 有机碘化物有机碘化物: :三碘苯甲酰匍萄糖胺等三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶胶硅溶胶: : 如如PercollPercoll。蛋白质蛋白质: :如牛血清白蛋白如牛血清白蛋白重水重水 非水溶性有机物非水溶性有机物: :如氟代碳等如氟代碳等 53 ( (二二).).梯度材料的应用范围梯度材料的应用范围 1.1.蔗糖蔗糖: : 水溶性大水溶性大 性质稳定性质稳定 渗透压较高渗透压较高 最高密度可达最高密度可达1.33g/ml,1.33g/ml, 价格低价格低 容易制备容易制备, , 常用于细胞器、病毒、常用于细胞器、病毒、RNARNA分离的梯度材料分离的梯度材料 有较大的渗透压有较大的渗透压, ,不宜用于细胞的分离不宜用于细胞的分离。 54 2. 2.聚蔗糖聚蔗糖: : 商品名商品名Ficoll, Ficoll, 渗透压低渗透压低 粘度却特别高粘度却特别高, ,为