酶免检测技术原理及影响

1、酶免检测技术原理及影响因素酶免检测技术原理及影响因素检验科检验科 孙文鲜3月月18日免疫室差错问题分析及整改措施日免疫室差错问题分析及整改措施3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗旨。针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施：1、端正态度、要认真、负责2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本 标记清楚3、增加人员缓解紧张工作状态4、欢迎大家给出宝贵建议5、坚持免疫室两

2、个原则免疫室简介免疫室简介检验项目检验项目普免术前四项（普免）术前四项（急筛复查）体检AFPCEA体检HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化学发光肿瘤性激素HCG贫血三项胰岛素C-肽自身免疫自免肝四项ENA谱抗核抗体抗线粒体抗体血管炎过敏原呼吸道HIV初筛实验室迎检任务前景展望检测方面：免疫球蛋白、补体、免疫细胞、细胞因子、免疫移植等，技术方面：电泳技术、细胞技术、分子生物学技术、流式细胞技等教学方面：华信临床检验技术专业免疫室简介免疫室简介工作人员工作人员 姓名姓名职称职称职务职务职责职责状态状态孙文鲜孙文鲜主管检验技师主管检验技师常规免疫常规免疫免疫室组长免疫室组长固定

3、人员固定人员刘丽娜刘丽娜主管检验技师主管检验技师发光免疫发光免疫免疫室质控管理员免疫室质控管理员固定人员固定人员史可史可检验师检验师自身免疫自身免疫免疫室生物安全及免疫室生物安全及感染控制管理员感染控制管理员固定人员固定人员冯凡冯凡检验员检验员常规免疫常规免疫免疫室仪器维护免疫室仪器维护及信息管理员及信息管理员固定人员固定人员夜班人员夜班人员科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干暂时固定暂时固定坚持两个原则：坚持两个原则：1 1、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性 2 2、坚持以病人为中心，全心全心全意服务病人、坚持以病人为中心，全心全心全意服

4、务病人免疫室简介免疫室简介免疫室日常工作量免疫室日常工作量（3 3月月2323日为例）日为例）项目标本量（人份）项目包括内容备注普筛88门诊、病房普筛，乙肝五项（ 酶免法）急筛复查47所有急筛（酶免法）发光51肿瘤、性激素、贫血三项、胰岛素、C-肽、HCG体检37AFP、CEA、乙肝五项、丙肝、普筛自免3自身免疫、呼吸道、过敏原、杂项9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM总计234免疫室简介免疫室简介免疫室特殊项目检测成本免疫室特殊项目检测成本项目成本（）项目成本（）项目成本（）项目成本（）备注AFP66.29FSH66.29Ferr52.51呼吸道63.98CEA6

5、6.29LH66.29Foll89.97过敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗体66.60CA19985.59T66.29胰岛素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗体69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA谱57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗线粒体抗体待定注：此统计结果可信度为95一、抗原抗体反应一、抗原抗体反应二、酶免疫技术的分类、原理及特点二、酶免疫技术的分类、原理及特点三、酶联免疫吸附试验三、酶联免疫吸附试验四、四、ELISAELISA法检测注

6、意事项法检测注意事项五、五、ELISAELISA法检测常见问题及解决方法法检测常见问题及解决方法一、抗原抗体反应一、抗原抗体反应抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理氢键结合力氢键结合力范德华引

7、力范德华引力静电引力静电引力疏水作用力疏水作用力抗抗原原抗抗体体结结合合力力抗原抗体反应特点及影响因素抗原抗体反应特点及影响因素抗原抗体反应特点：抗原抗体反应特点：1 1、特异性、特异性 2 2、比例性、比例性 3 3、可逆性、可逆性抗原抗体反应影响因素：抗原抗体反应影响因素：1 1、反应物自身因素：抗原、反应物自身因素：抗原 抗体抗体2 2、反应环境条件：电解质、反应环境条件：电解质 酸碱度酸碱度 温温 度度抗原抗体反应影响因素：抗原抗体反应影响因素：1 1、反应物自身因素：、反应物自身因素： 抗原抗原 理化性状、表位种类、数目理化性状、表位种类、数目 抗体抗体 来源、特异性、亲和性、效价来

8、源、特异性、亲和性、效价2 2、反应环境条件：、反应环境条件： 电解质电解质 85g/LNaCl85g/LNaCl溶液溶液 酸碱度酸碱度 pH6-9pH6-9为宜为宜 温温 度度 最适温度为最适温度为3737二、酶免疫技术的分类、特点及原理二、酶免疫技术的分类、特点及原理1 1、酶免技术的分类、酶免技术的分类.酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 酶免疫测定酶免疫测定液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量均相均相 异相异相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相液相酶免疫测定酶免疫测定1、酶放大免疫测定技术EMI

9、T2、克隆酶供体免疫分析CEDIA分离结合、游离酶标记物，底物测定检测微量短肽激素、小分子抗原最广泛，酶联免疫吸附试验小分子激素、半抗原测定 酶免技术的分类酶免技术的分类2 2、酶免技术特点、酶免技术特点抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 +酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性 主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原 酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性3 3、酶免技术原理及特点、酶免技术原理及特点二、酶联免疫吸附试验二、酶联免疫吸附试验1 1、基本原理基本原理.原理原理包被包被12反应反应加入待测抗体或加入待

10、测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体3洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离4底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析三个必要试剂三个必要试剂 固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物酶反应的底物 .双抗体夹心法（测抗原）双抗体夹心法（测抗原）方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色加底物显色应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 HBsAgHBsAg、HBeAgH

11、BeAg、甲胎蛋白、甲胎蛋白、HCGHCG等等.2 2、方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理双位点一步法（测抗原）双位点一步法（测抗原）方法：方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原酶标抗原同时加入，加底物显色酶标抗原同时加入，加底物显色应用：应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏度，需注意度，需注意“钩状效应钩状效应”竞争法竞争法（测抗原）（测抗原） 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检

12、物竞争与包被物结合。加底物显色原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）激素等）方法类型及反应原理方法类型及反应原理.双抗原夹心法双抗原夹心法（测抗体）（测抗体）原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理间接法间接法（测抗体）（测抗体）方法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人人Ig

13、GIgG（抗抗体或二抗）加底物显色。（抗抗体或二抗）加底物显色。优点优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定测定方法类型及反应原理方法类型及反应原理竞争法竞争法（测抗体）（测抗体）原理：原理：类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法应用应用：乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)(HBcAb)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)的检测的检测 方法类型及反应原理方法类型及反应原理捕获法捕获法（测抗体）

14、（测抗体） 应用：应用：病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体四、四、ELISAELISA法检测注意事项法检测注意事项1 1、标本、标本避免溶血、避免溶血、高脂血、高脂血、纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块尽量新鲜，避免细菌污染尽量新鲜，避免细菌污染 一般一般5 5天内检测的血清可天内检测的血清可44保存，否则低温保存。保存，否则低温保存。 2 2、 试试 剂剂. .试剂盒保存于试剂盒保存于2-82-8. .使用前应先将检测试剂使用前应先将检测试剂 盒

15、放置室温平衡盒放置室温平衡15-3015-30 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。活性剂的溶解。. .观察外包装和内组份有无漏液。观察外包装和内组份有无漏液。 3 3、加、加 样样 A. A. 加样不可太快；加样不可太快； B. B. 要避免加在孔壁上部；要避免加在孔壁上部； C. C. 不可溅出；不可溅出； D. D. 避免产生气泡；避免产生气泡； E. E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。头，加样后充分混匀。加样器定期校准！加样器定期校准！温育温度的选择温育温度的选择足够的反应时间足够的反应时

16、间“边缘效应边缘效应”的排除的排除4 4、温、温 育育5 5、洗、洗 板板 6 6、显、显 色色u 检查底物溶液的有效性；检查底物溶液的有效性；u 试剂显色时先加试剂显色时先加A A液，液， 后加后加B B液，二者不要颠倒。液，二者不要颠倒。 前后加入的间隔时间前后加入的间隔时间 不超过不超过1010分钟，不漏加。分钟，不漏加。uA A、B B液应避免接触污染物。液应避免接触污染物。u不同厂家、批次酶显色液不同厂家、批次酶显色液 不得混用不得混用 7 7、终止和读数、终止和读数p肉眼判断不准确，影响结果肉眼判断不准确，影响结果p酶标仪的波长选择的问题。酶标仪的波长选择的问题。p加完终止液后加完

17、终止液后3030分钟内读取数据。分钟内读取数据。p保证酶标板的底部是清洁干燥的。保证酶标板的底部是清洁干燥的。p酶标仪临界值计算公式的设定酶标仪临界值计算公式的设定8 8、结果判读、结果判读 项目项目CUTOFFCUTOFF阳性判断阳性判断HIVHIV（科华）（科华）0.10.1MINMIN（PCxPCx，2.5)2.5)cutcutHIVHIV（丽珠）（丽珠）0.15+MAX(NCx,0.08)0.15+MAX(NCx,0.08)cutcut灰区又称灰色带反灰区又称灰色带反应。就是把应。就是把ODOD值在值在Cut offCut off值正负值正负20%20%这个范围内的标本这个范围内的标本

18、称为灰区标本。这称为灰区标本。这个范围称为灰区。个范围称为灰区。. .灰区是客观存在的，没灰区是客观存在的，没有不存在灰区有不存在灰区 的试剂，的试剂，我们只是尽量减少灰区的我们只是尽量减少灰区的出现比例。出现比例。. .减少灰区最有效的方法减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干净。就是尽量将板洗涤干净。不同试剂盒不同试剂盒，CUTOFFCUTOFF值计算方法不同值计算方法不同例：五、五、ELISAELISA法检测常见问题及解决方法法检测常见问题及解决方法ELISAELISA实验常见问题及解决方法实验常见问题及解决方法p 类风湿因子类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，

19、因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。p 补体：补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低p 异嗜性抗体：异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。p 溶菌酶：溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。p 溶血溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。p 细菌污染：细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。p 标本标本44存放过久：存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议1:201:20准确配置洗涤液1010、试剂盒运输时间太长，受高温影响、试剂盒运输时间太长，受高温影响夏天长途运输时，缩短时间，低温措施1111、试剂盒失效、试