免疫组化2010

1、免疫组织化学技术免疫组织化学技术 基础医学院中心实验室生物技术教研室一、一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围免疫组织化学技术的原理和应用范围 （一）（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术的基本原理 免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。进行定性、定位、定量测定的一项技术。 1 特异性抗体的制备特异性抗体的制备 先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，先将组织或细胞中的某些化学物

2、质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体制备特异性抗体 2 用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体制备第二抗体 3 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大 4 4 显色显色 由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来化学方法将抗原

3、抗体反应部位显示出来（常用显色剂（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。显示为棕黄色颗粒）。 5 5 显微镜观察、定位显微镜观察、定位 通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。些化学成分的分布、含量。 组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂

4、、受体、酶、激素、核酸及病原体磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。等都可用相应的特异性抗体进行检测。特异性、敏感性、定位特异性、敏感性、定位免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示上讲也是组织细胞中抗原的特定显示 ABC法或法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫万倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。组织化

5、学技术又具有敏感性高的特点。 免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。并进行形态与功能相结合的研究。（二）免疫组织化学技术的应用范围（二）免疫组织化学技术的应用范围 近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是自进，特别是自70年代中期杂交瘤技术与单克隆年代中期杂交瘤技术与单克隆抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度

6、的特抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。 1 确定细胞类型确定细胞类型通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列确定细胞类

7、型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚蛋白等）能清楚显示其形态。显示其形态。 2 辨认细胞产物辨认细胞产物利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，利用

8、某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。瘤等。 3 了解分化程度了解分化程度大多数标记物都有其特定的分布部位，大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在着色部位在细胞膜上，但分化差的乳癌胞浆内也可细胞膜上，但分化差的乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化出现阳性颗粒；角蛋白的

9、含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。染色较弱。 4 鉴定病变性质鉴定病变性质标记标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有意义。在滤泡型淋巴应性滤泡增生上有意义。在滤泡型淋巴瘤，瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白。蛋白。5 发现微小转移灶发现微小转移灶某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用

10、常规病理组织学方法要在胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。性细胞，提示前列腺癌转移。 6 探讨肿瘤起源或分化表型探讨肿瘤起源或分化表型一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后

11、通过一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。其来源。 7 确定肿瘤分期确定肿瘤分期判断肿瘤是原位还是浸润及有

12、无血管、判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和层粘连蛋白和型胶原的单克隆抗体可型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。而是浸润癌了，其预后是不同的。 用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细

13、胞的标记物则可示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。时也有治疗及预后意义。 8 指导预后和治疗指导预后和治疗免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：三类：类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗

14、效果较好，预后也较好。体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。肿瘤基因标记：如癌基因肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。较低，预后较好。细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、）、增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）、）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越等，表达指数越高，表明其增殖越活跃

15、，恶性度越高，预后不良，其中以活跃，恶性度越高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。激素受体的表达呈负相关。 9 辅助疾病诊断和分类辅助疾病诊断和分类人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫

16、复合物等进行检测以辅助诊断。免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为标志不同可分为T细胞性、细胞性、B细胞性。肾小球细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技肾炎的免疫学分类亦需免

17、疫组化或免疫荧光技术。术。 10 寻找感染病因寻找感染病因人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、）、人乳头人乳头状瘤病毒（状瘤病毒（HPV）、）、单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）、）、乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物等，已有商品

18、化标志物帮助解决病因诊断问题。帮助解决病因诊断问题。二、标本的制备与固定二、标本的制备与固定（一）标本的处理（一）标本的处理 标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存良好，抗原物质的抗原不固定及时，形态保存良好，抗原物质的抗原不丢失，不扩散或不被破坏。标本的处理过程中丢失，不扩散或不被破坏。标本的处理过程中应该注意以下两个方面：取材、固定。应该注意以下两个方面：取材、固定。1 取材取材细胞标本取材有：细胞标本取材有：印片法印片法穿刺吸取涂片法穿刺吸取涂片法体

19、积沉淀涂片法体积沉淀涂片法培养细胞标本取材培养细胞标本取材离心涂片机法离心涂片机法1.1 印片法印片法主要应用于活检组织标本和手术切除标主要应用于活检组织标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落细胞便粘附于玻片上，立即浸入细脱落细胞便粘附于玻片上，立即浸入细胞固定液内胞固定液内510分钟，取出后自然干燥，分钟，取出后自然干燥，低温保存备用。低温保存备用。1.2 穿刺吸取涂片法穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、

20、软组织等。用细胞针穿刺吸取病变区淋巴结、软组织等。用细胞针穿刺吸取病变区内液体成分，可直接涂抹在玻片上，力求细胞内液体成分，可直接涂抹在玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法，即将穿刺液滴入盛有涤法，即将穿刺液滴入盛有12ml Hank（或或RPMI-1640）液的试管内，轻轻搅拌，以液的试管内，轻轻搅拌，以500r/min低速离心低速离心510min后，弃上清液，将后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（沉淀制成细胞悬液（1106细胞细胞/ml），），吸取吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹或用离心涂片机制成滴于载玻片上，轻轻涂抹或用离心涂片机

21、制成涂片，待涂片略干即可固定。涂片，待涂片略干即可固定。 1.3 体积沉淀涂片法体积沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不同的处理方法：不同的处理方法：细胞数量极多者，可吸取细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上；少量液体直接涂在玻片上；细胞数量少者，细胞数量少者，可将液体沉淀，然后取沉淀液以可将液体沉淀，然后取沉淀液以1500r/min离离心心10min，弃上清，将细胞涂片或

22、用离心涂片弃上清，将细胞涂片或用离心涂片制成涂片，略干后固定备用。制成涂片，略干后固定备用。 1.4 培养细胞标本取材培养细胞标本取材根据培养细胞特性分别采用不同的方法。根据培养细胞特性分别采用不同的方法。对某些贴壁生长的细胞，只需将载玻片对某些贴壁生长的细胞，只需将载玻片插入培养瓶内即可制备理想的细胞标本。插入培养瓶内即可制备理想的细胞标本。而对于浮悬培养的细胞，可用离心涂片而对于浮悬培养的细胞，可用离心涂片机制成涂片。机制成涂片。 1.5 离心涂片机法离心涂片机法将待涂片的细胞样品成将待涂片的细胞样品成21056/ml的细的细胞悬液，吸取胞悬液，吸取50100l加入涂片机内，加入涂片机内，

23、1000r/min离心离心2min后细胞就均匀地分后细胞就均匀地分布于玻片上。布于玻片上。制备细胞涂片应注意：制备细胞涂片应注意：标本反复离心洗涤后，细胞黏附性降低，在免标本反复离心洗涤后，细胞黏附性降低，在免疫染色过程中易脱落，因此，在制片前载玻片疫染色过程中易脱落，因此，在制片前载玻片上应涂黏附剂；上应涂黏附剂；为节省试剂和便于观察，应将细胞集中在为节省试剂和便于观察，应将细胞集中在0.61cm2的圆圈内，细胞总数以的圆圈内，细胞总数以105个为宜；个为宜；黏液丰富的标本，如痰液、胃液，未经特殊处黏液丰富的标本，如痰液、胃液，未经特殊处理，一般不宜作免疫组织化学染色。理，一般不宜作免疫组织

24、化学染色。组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；取材部位主要是病变区，但必须取病灶与正常取材部位主要是病变区，但必须取病灶与正常组织交界区；组织交界区；必要时取远距病灶区的正常组织作对照；必要时取远距病灶区的正常组织作对照；为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，也可贮于液

25、氮或也可贮于液氮或-70保存。保存。 2 固定固定固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。首先，通过固定可使细胞内蛋白质凝固，防止细首先，通过固定可使细胞内蛋白质凝固，防止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固有形态和结构；有形态和结构；其次，通过固定可以保存组织细胞的抗原性。固其次，通过固定可以保存组织细胞的抗原性。固定不足，抗原会丢失；固定过度，则抗原性质定不足，抗原会丢失；固定过度，则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。改变或抗原成分被遮蔽。 2.1 固定液的选择固定液的选择固定液的选择是免疫组化技术成功与否固

26、定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是：选择最佳固定液的标准是：最好地保持细胞和组织的形态结构；最好地保持细胞和组织的形态结构；

27、最大限度地保存抗原的免疫活性。中性最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲液多聚甲醛（或福尔马林）是适应缓冲液多聚甲醛（或福尔马林）是适应性较为广泛的固定液。值得注意的是免性较为广泛的固定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。液。2.2 固定时间因固定液而异固定时间因固定液而异组织固定时间最好在组织固定时间最好在l2h内，一般固定时内，一般固定时间不应超过间不应超过24小时。随着固定时间的延小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。 2.3 固定方法的选择固定方法的选择常用的固定方法有两种：常用的

28、固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在的性质而定，一般在2-12h之间。之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。 2.4 固定时应注意固定时应注意力求保持组织新鲜，勿使其干燥；力求保持组织新鲜，勿使其干燥

29、；组织块不宜过大过厚，以体积组织块不宜过大过厚，以体积20 nm）标记的间接抗体或标记的间接抗体或A蛋白再与蛋白再与特异性抗体结合，在光镜下就可见红色特异性抗体结合，在光镜下就可见红色的反应物出现，不需进行呈色反应。但的反应物出现，不需进行呈色反应。但该法要求金标抗体浓度高，因此，价格该法要求金标抗体浓度高，因此，价格昂贵，既不经济同时也不够敏感。昂贵，既不经济同时也不够敏感。 2免疫金银染色（免疫金银染色（IGSS）是在免疫金染色的是在免疫金染色的基础上，在对苯二酚存在的情况下，通过含银基础上，在对苯二酚存在的情况下，通过含银离子的显影液中的还原反应，使在抗原抗体反离子的显影液中的还原反应，

30、使在抗原抗体反应部位的金粒子周围形成很多沉淀层，光镜下应部位的金粒子周围形成很多沉淀层，光镜下就可看到阳性反应部位呈清晰的棕黑色，从而就可看到阳性反应部位呈清晰的棕黑色，从而显示不易被光镜定位的金粒，显示出组织中抗显示不易被光镜定位的金粒，显示出组织中抗原的部位。这种方法不仅提高灵敏度，同时金原的部位。这种方法不仅提高灵敏度，同时金标记抗体可以稀释标记抗体可以稀释10倍以上后应用，此外还可倍以上后应用，此外还可避免使用具有致癌危险的有机色素。避免使用具有致癌危险的有机色素。 IGSS法的主要优点是：法的主要优点是： （1）敏感性高。与其他的免疫组织化学技术）敏感性高。与其他的免疫组织化学技术相

31、比，相比，IGSS法被认为是最敏感的方法，尤其法被认为是最敏感的方法，尤其适合于只含微量抗原的组织标本。适合于只含微量抗原的组织标本。 （2）应用范围广。）应用范围广。IGSS法不仅可以在冰冻切法不仅可以在冰冻切片，细胞涂片以及培养细胞、石蜡切片上进行片，细胞涂片以及培养细胞、石蜡切片上进行光镜观察，而且还能应用于树脂包埋的切片的光镜观察，而且还能应用于树脂包埋的切片的电镜观察，并且能准确定位抗原。电镜观察，并且能准确定位抗原。 （3）定位准确。）定位准确。IGSS法的银颗粒沉积在搞原法的银颗粒沉积在搞原体反应部位，一般无扩散，定位较为准确。体反应部位，一般无扩散，定位较为准确。 （4）方法简

32、便、安全、成本低、经济、同时）方法简便、安全、成本低、经济、同时标本也可以长期保存。标本也可以长期保存。 （5）用醋酸银代替硝酸银和乳酸银，不仅保）用醋酸银代替硝酸银和乳酸银，不仅保持了原有方法的敏感性、特异性、低背景、对持了原有方法的敏感性、特异性、低背景、对比度好的特点，而且整个显影过程可以在常光比度好的特点，而且整个显影过程可以在常光下进行，从而弥补了在暗室显色的不足。下进行，从而弥补了在暗室显色的不足。 IGSS法的主要问题是非特异性背景，由法的主要问题是非特异性背景，由于其非特异性背影染色影响了于其非特异性背影染色影响了IGSS法在法在常规免疫组织化学鉴别诊断上的应用。常规免疫组织化

33、学鉴别诊断上的应用。但若能较好地控制染色的各关键环节，但若能较好地控制染色的各关键环节，如特异性抗体的纯度，特异性；切片的如特异性抗体的纯度，特异性；切片的消化以及显影液的配制和显影时间的控消化以及显影液的配制和显影时间的控制等，能较好地解决这一问题。制等，能较好地解决这一问题。 四、免疫组织化学技术试剂购买及其保存四、免疫组织化学技术试剂购买及其保存 （一）（一） 免疫组织化学技术试剂正确选择、免疫组织化学技术试剂正确选择、购买及使用购买及使用1 一抗的正确选择与使用一抗的正确选择与使用1.1 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点

34、，特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。减少染色背景。 1.2 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。结合位点。1.3 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但由于供应商质检所用组织

35、不同，使用方法。但由于供应商质检所用组织不同，实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己再重新选择比例。一般供应商提供稀释比例从再重新选择比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始作倍比稀释。稀释度始作倍比稀释。 2 二抗的正确选择与使用二抗的正确选择与使用2.1 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国Vector公司和公司和Zymed公司都有开发的用小鼠

36、抗公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠内源性小鼠Ig的封闭液，可以得到清晰的染色背的封闭液，可以得到清晰的染色背景。景。 2.2 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠鼠IgG1，可以选用山羊抗小鼠的可以选用山羊抗小鼠的Ig或或IgG1的二抗。的二抗。2.3

37、正确使用：也需要重新选择稀释比例。正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般供应商提供稀释比例从一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度稀释度始，作始，作5倍比稀释。倍比稀释。 3 检测系统的正确选择检测系统的正确选择检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统：亲和素系统：亲和素-生物素放大系统很常用，但生物素放大系统很常用，但由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经典的典的SP、SRABC和和LSAB法等常出现背景法等常出现背景着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。染色时很难避免。 购买时要求试剂公司提供标准化的试剂，并附购买时要求试剂公司提供标准化的试剂，并附详细的试剂说明书，例如抗体的说明书应包括详细的试剂说明书，例如抗体的说明书应包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和冲液的适宜离子强度和PH值等。经广泛的文值等。经广泛的文献查阅及与使用者的多次交流，