辣根过氧化物酶标记ppt课件

1、辣根过氧化物酶标志辣根过氧化物酶标志抗体技术及运用进展抗体技术及运用进展8310023283100232王伟航王伟航实验原理实验原理1免疫标志技术 免疫标志技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标志到特异性抗原或抗体分子上，经过这些标志物的加强放大效应来显示反响系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标志物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标志物进展标志的免疫检测技术被称为3大免疫标志技术。目前，运用的免疫标志物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。2辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)标志抗体的原理标志抗体的原理a. 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxida

2、se, HRP HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多个同功酶组成，分子量为由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为等电点为pH39，酶催化的最适，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差因供氢体不同而稍有差别，但多在别，但多在pH5左右。酶溶于水和左右。酶溶于水和58以下的硫酸铵溶液。以下的硫酸铵溶液。HRP的辅的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和和275nm，普通以，普通以OD403nm OD275nm的比值的比值RZ(

3、德文德文Reinheit Zahl)表示酶的纯表示酶的纯度。度。 HRP的催化反响需求底物过氧化氢的催化反响需求底物过氧化氢(H2O2)和供氢体和供氢体(DH2)。供氢。供氢体多为无色的复原型染料，经过反响可生成有色的氧化型染料体多为无色的复原型染料，经过反响可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2H2O2D2H2Ob. 辣根过氧化物酶标志方法辣根过氧化物酶标志方法 酶标志抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化酶标志抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。法。 辣根过氧化物酶的标志常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于辣根过氧化物酶的标志常用过碘酸盐氧化

4、法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子外表的多糖氧化为醛基，醛基与分子外表的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基构成抗体分子上的氨基构成Schiff碱而结合。后者可进一步用碱而结合。后者可进一步用NaBH(或乙醇或乙醇胺胺)复原生成稳定的酶标志抗体。复原生成稳定的酶标志抗体。 在酶标过程中普通都混有未结合的酶和抗体。游离酶实际上不影响最终的显色。但游离的抗体那么不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需求对制备的酶结合物进展纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交

5、换层析、分子筛法可得到最正确的分别效果，但费用较贵。 四 操作步骤 1称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。2向溶液中参与0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混匀， 4静置30分钟。3参与0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。4参与含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4过夜。5加加0.2 mL 新配的新配的5 mg/mL NaBH液，混匀，再置液，混匀，再置4 , 2h。6在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置4 1h。73000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗离心半小时，

6、弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的的PBS中。中。8 将上述溶液装入透析袋中，对将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的的PB缓冲缓冲盐水透析，去除铵离子后盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。酶制剂及其底物 凡无毒性又能呈现有色化学反响的酶，原那么上均可作为标志用。但作为标志抗体用的 酶应满足以下要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比

7、活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简一方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH39,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差别，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大

8、吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得留意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。HRP的催化反响需求底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的复原型染料，经过反响可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反响的过程如下:HRPDH2H2O2D2H2O供氢体的种类很多，构成的产物特点不一。如DAB(3.3二氨基联苯胺)的反响产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜察看。5AS

9、(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少运用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生艳丽的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反响中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需求在短时间内进展测定。目前用得较广泛和较称心的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者构成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。 另外，还有一种供氢体称ABTS2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺 酸)，其反响产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在能够性方

10、面， ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反响中运用的H2O2不能过量。应 控制在经较短时间反响后呈色即达顶峰阐明HO已耗费殆尽。这样即使再延伸时间 也不会添加反响产物的颜色。HRP标志抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的构造不同可采用不同的方法。对于制备HRP结 合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法 1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，经过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共 价结合，构成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标志步骤： (1)称取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于

11、室温静置过夜。 (2)反响后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml1分 钟，搜集棕色流出液。如体积大于5ml，那么以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅 拌。 (3)将待标志的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴参与酶溶液中。 (4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。 (5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6)在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置41小时。 (7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 (

12、8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用 萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保 存。3.结果断定： (1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标志抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作 双向琼脂分散实验或免疫电泳实验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。 最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进展滴定( 见本节 (三)任务浓度的选 择)。(2)定量和克分子比值测定： (2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mgml)OD403nm0.4 IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62 酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量 克分子比值 4 40,000 160,000IgG量本卷须知1为提高标志效率，应严厉掌握整个反响体系中9的抗体含量。2碘酸钠要新颖配制。3.室温搅拌时须避光，室内温度普通在25为宜。标志物每次透析前，须仔细检查，防止漏液本卷须知 4在具备高质量HRP的条件下，所要标志的抗体也要活性高,效价高(最低1 16)