第34章 DNA的复制和修复(2015-5-11) 3

1、第34章 DNA的复制和修复DNA Replication and RepairDNA Replication DNA复制 DNA修复合成 反转录DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。 DNA生物合成第一节 DNA的生物合成DNA生物合成的方式：（一）（一）. DNA半保留复制半保留复制 1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时，就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。 1、半保留复制半保留复制(semiconservative replication)：定义定义：DNA复制的一种方式，每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代

2、链和一条新合成的链组成。 P408DNA复制具有两个特点：（复制具有两个特点：（半保留复制半保留复制）和（和（半不连续复制半不连续复制） 一、一、DNA复制复制弥散式弥散式 possible copying mechanism OF DNA DNA复制方式有三种可能性复制方式有三种可能性：全保留、半保留和分散全保留、半保留和分散式。式。 2. DNA半保留复制的证明(两个)( (1) ) 密度梯度离心密度梯度离心 ( (重同位素标记重同位素标记）1958年Meselson和Stahl采用重同位素重同位素15N作DNA标记，同时可以否定另外两种复制方式 密度梯度离心(2) 放射性同位素自显影 1

3、963年，Cairns设计了一个更为严谨的实验放射放射自显影自显影的方法，进一步证实了DNA的半保留复制； 1957年，Taylor的实验证明，在真核生物中，DNA的复制也是半保留的B:（双链标记） A和C:（单链标记）H3-标记的脱氧胸苷脱氧胸苷 单链DNA首先复制合成双链的复制型复制型（单链DNA复制时，通常先形成双链复制型，再进行半保留复制）。 无论是复制、转录或逆转录，在形成双链螺旋分子时都是通过碱基配对来完成的。半保留半保留复制非常普遍 DNA半保留复制的意义 意义意义：按半保留复制方式，子代：按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的碱的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传

4、信息，体现了遗基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的。传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的。1. 设计实验证明设计实验证明DNA是半保留复制是半保留复制 -2012大连理工大学生物化学2. 猪流感病毒猪流感病毒HRN1是反转录病毒，试想出实验方案以阻止是反转录病毒，试想出实验方案以阻止病毒在细胞内复制而不影响细胞内病毒在细胞内复制而不影响细胞内DNA正常复制正常复制 -2012山东大学生物化学3. 简述Mettew Meselson和Franklin Stahl设计了一个什么样的实验,证实DNA的复制是半保留复制思考题思考题 华东

5、师范大学2007年生物化学思考题思考题20102010年南开大学年南开大学（二）、半不连续复制（二）、半不连续复制（P418） （1）DNA聚合酶只能在53方向延长DNA （2）DNA是反向双螺旋 DNA聚合酶如何同时完成2条链的复制 ? ?半不连续复制 定义：定义： DNA一条链连续合成和另一条链不连续合成的复制方式,称为DNA的半不连续复制半不连续复制。 DNA聚合酶只能按53方向催化合成DNA，不能催化35方向合成, 领头链领头链随从链随从链冈崎片段冈崎片段: :引物引物半不连续复制(续1) 领头链领头链:对应3 5的模板链，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。

6、随从链随从链:对应53的模板链，复制的方向与解链方向相反，复制不是连续延长复制不是连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。 冈崎片段冈崎片段: :随从链中不连续的DNA片段称为冈崎片段。 原核生物原核生物: : 10002000个核苷酸，相当于一个顺反子真核生物真核生物: : 100200个核苷酸（相当一个核小体）思考题1. 是非判断题是非判断题 DNA分子是由两条链组成，其中一条链作为前导链的模分子是由两条链组成，其中一条链作为前导链的模板，另一条链作为后随链的模板板，另一条链作为后随链的模板。 厦门大学厦门大学2005年生物化学年生物化学前导链和滞后链是针对某个复制叉而言的 思思 考考 题

7、题（1）如何证明冈崎片断的存在如何证明冈崎片断的存在？（2）最初对冈崎片断测定的实验表明，其数量远超过新合成最初对冈崎片断测定的实验表明，其数量远超过新合成 DNA的一半，好象两条链都是不连续的，试分析原因的一半，好象两条链都是不连续的，试分析原因？提示：（1） 同位素标记dNTP，经过一段时间后终止合成， 检查发现标记出现在小片段DNA上，且小片段 DNA分子量相同，数量较多。 （2）前导链会少量的dUMP掺入，后尿嘧啶碱基被切除 形成AP位点，后该处磷酸二酯键打断，部分核苷 酸，水解，造成一个缺口，后被修复，该过程会产 生一些类似冈崎片断的DNA片段。P418脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dU

8、TP一旦形成就被转化成dUMP ?dUTPase活性高低的影响？DNA复制复制DNA复制复制XUUAAUUAA 解 释糖苷酶糖苷酶(ung)+ )+ 其他酶U等被切除等被切除（如果糖苷酶失活ung-，结果会如何？），结果会如何？）判断：判断：DNA聚合酶可以利用dUTP做底物。 解 释UUdenature 糖苷酶糖苷酶- ung dump 片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈奇片段AA dut dump 片段越短dUTPase DNA 没有U ！ 解释解释 E.coli dUTPase，它能使 dUTP变成 dUMP， dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中

9、。 尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N- glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无 Pu和 Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。 解解 释释 (1) 在 dut -突变体（ dUTPase缺失）中冈崎片段比在 dut +中为短。这是因为U掺入机会增加； (2) 在 ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。 (3) 因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。 在 dut-,

10、ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。思考题1. 细胞DNA复制是半不连续的，这是因为： A. DNA 聚合酶只能从35 合成DNA链 B. 模板双链是反平行的 C. DNA 聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基 D. DNA 酶法合成是个自发过程 南开大学2006年生物化学2. 论述半保留复制和半不连续复制的过程 2011年天津大学生物化学思考题3. DNA是以半保留方式进行复制的，如果放射性全标记的双链DNA分子在无放射性标记的溶液中经两次复制，那么所产生的4个DNA分子其放射性状况如何？ A、两个分子含有放射性； B、全部含有放射性； C、双链中各有一半含有放射性

11、； D、所有分子的两条链都没有放射性。 华南理工大学2006年生物化学思考题3. DNA复制时候后随链是冈崎片段，为什么前导链也是小片段 山东大学2010年生物化学二二、DNA复制的起点和方式复制的起点和方式 复制子复制子:基因组中可以独立进行复制的单位基因组中可以独立进行复制的单位， 它包括DNA每条链的一个复制起点序列，可能还有一些终止序列。（复制在复制在起始阶段进行调控起始阶段进行调控, ,一旦起始，将复制下去，直到完成）一旦起始，将复制下去，直到完成）1、原核生物和病毒为单复制子单复制子，真核生物为多复制子多复制子P408思考题 冈崎片段冈崎片段不是一个复制子，其起点也非复制起点 复制

12、的类型和方式复制的类型和方式 复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。复制叉。（1）、直线双向复制直线双向复制 单点双向单点双向：T7 多点双向多点双向：真核染色体DNA（2）、型复制：型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.） 复制的类型和方式复制的类型和方式 首先将E.coli染色体，切成1%染色体长度的片段，分别进行（分子杂交）分子杂交），后放射自显影大肠杆菌OriC在liv位点P409 大肠杆菌复制起点大肠杆菌复制起点：OriC（ori

13、gin of Chromosomal replication） 2、复制往往具有一定的起点 复制的方向判断 先低放射性先低放射性再高放射性再高放射性（3H-脱氧胸苷脱氧胸苷）P409DNA复制起点的特点（1）复制起点较保守富含AT，含一些反向重复反向重复序列（2）两条链复制起点可以在不同的点上（如：D-环复制）（3）DNA复制的控制在起点控制复制的控制在起点控制，复制的速度决定于起始复制的速度决定于起始 频率（延伸的速度比较恒定，不决定于培养基状况）频率（延伸的速度比较恒定，不决定于培养基状况） DNA链的呼吸作用：链的呼吸作用：DNA（复制原点处）氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链

14、与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。判断题 1. 通常DNA复制终止时并不需要特定的信号。 () 中山大学2002年生物化学试题 2. 真核生物DNA复制起点的序列专一性要低于细菌和病毒 （）.思考题特殊的复制方式特殊的复制方式滚环复制 主要发生在病毒主要发生在病毒中,细菌F因子(F factor)；如X174 噬菌体 （单向复制？） 在正链正链DNA上打开一个切口切口； 以切口的3-端为引物开始合成环链DNA的互补链，取代开环的链；3-OHP410滚环复制滚环复制NOTE: can get single unit genomes or multimeric copies 单向复制单向复制 复

15、制的类型和方式复制的类型和方式滚环复制滚环复制E. coli phage (噬菌体）: X174 “Template “rolls”, extrudes leading strand Okazaki frags made on leading strand as it emerges. 单向复制单向复制 ？ 特殊的复制方式特殊的复制方式- -D环复制D环复制环复制： 线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA（不对称复制，两条 链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条 链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才 暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制， （单向复制，全连续复制，没有冈崎

16、片段）（单向复制，全连续复制，没有冈崎片段） D-环扩充越过被取环扩充越过被取代链的复制起点；代链的复制起点； 被取代链启动复制，方被取代链启动复制，方向与第一条链相反；向与第一条链相反； 两条链的合成没有冈崎两条链的合成没有冈崎片断片断单向复制，全连续复制单向复制，全连续复制 特殊的复制方式特殊的复制方式- -D环复制 特殊的复制方式特殊的复制方式- -2D环复制叶绿体DNA复制的类型和方式复制的类型和方式多复制叉复制多复制叉复制 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。 DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实复制的速率实际上取决于起

17、始频率。际上取决于起始频率。 E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟4.2X106/（50KbX2）=42。富营养时，可采取多复制叉复制方式，结果结果20min可以可以复制一代复制一代。 真核生物真核生物DNA的复制 真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。 1. 一条染色体上具有多个复制子，同一染色体上，各复制子长度不同。 2. 不同生长期，复制子数目不同。 如果蝇，生长旺盛期，细胞快速分裂，复制子数目可扩增十倍。 3. 每个每个复制起点复制起点在每个复制周期中只启动一次。在每个复制周期中只启动一次

18、。 4. 相邻复制子的终点是随机碰撞会合的。1. 已知大肠杆菌在37 摄氏度时双向复制一次约需40分钟，但在这些培养基内，细菌分裂可达20 分钟一次，为什么？ 中山大学2000年生物化学试题思考题2、名词解释：滚环复制2013山东大学3、判断：滚环复制是噬菌体DNA 在细菌中最常用的一种复制方式2008南京大学4 4、滚滚滚环复制滚环复制（BDE） A、是细胞DNA的主要复制方式。 B、可以使复制子大量扩增。 C、产生的复制子总是双链环状拷贝。 D、是噬菌体DNA在细菌中最通常的一种复制方式。 E、复制子中编码切口蛋白的基因的表达是自动调节的思考题三、 DNA复制有关的酶及蛋白质因子 底物底物

19、：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 模板模板（template）：解开成单链的DNA母链 引物引物（primer）：提供3-OH末端(体内为RNA, 体外为DNA, 如 PCR反应) 酶及蛋白质因子酶及蛋白质因子 DNA聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶 解链（解旋酶）类，单链结合蛋白 引物酶，拓扑异构酶 DNA连接酶（P410） 需4 种dNTP（不是不是dNDP、dNMP、NTP） 需DNA模板模板 需引物引物 (DNA、RNA) 53方向越长 （化学合成方向与此相反）P413DNA聚合反应和聚合酶 DNA + dNTP = DNA(n+1) + PPiDNA聚合酶反应的特

20、点 DNA + dNTP = DNA-dNMP + PPi-磷酸磷酸dNTP思考题思考题1. 一个同学想研究一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是标记的磷是第第3位的磷，问是否能够达到目的位的磷，问是否能够达到目的。 2012年山东大学生物化学年山东大学生物化学思考题思考题2. 用放射性磷元素标记dNTP的-磷酸磷酸，参与DNA合成，分离后用检测其放射性以确定在合成过程中标记核苷酸掺入的量1）、这一过程的化学原理2）、如只标记一种dNTP放射性检测结果会有什么不同3）、如果在加入时不小心漏加了一种核苷酸，对放射性的影响4）、如标记其它位置

21、的磷元素结果如何。 2012年山东大学生物化学 2. 大肠杆菌的DNA聚合酶DNA聚合酶： DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶（聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。（P414） （1）.大肠杆菌的DNA聚合酶 I 单链单链球状蛋白，含锌锌原子，多功能酶。 5 3DNA 聚合酶聚合酶活力（使DNA 链从53方向延长） 3 5 核酸外切酶核酸外切酶活力，起校正校正功能； 5 3 核酸外切酶活

22、核酸外切酶活力，切除引物或修复由紫外线照射 而形成的嘧啶二聚体； 聚合反应的逆反应聚合反应的逆反应（由3端焦磷酸解） DNA + dNTP = DNA-dNMP + PPi DNA复制过程中碱基对受双重校对 （DNA聚合酶聚合酶选择作用选择作用）（3 5外切酶外切酶的校对作用）的校对作用）DNA聚合酶的右手装结构没有校对作用的错误率没有校对作用的错误率：10-5，有校对作用的错误率有校对作用的错误率5x10-7 35外切酶活性校对作用 某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4 DNA聚合酶的35外切酶活性很低，起着促突变因子的作用。 相反，另外一些具

23、有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，35外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。 DNA聚合酶I的部分水解DNA-pol木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶N 端C 端小片段大片段/Klenow 片段 53核酸外切核酸外切酶活性酶活性 DNA聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性（P414）DNA聚合酶 I的特点 Klenow 片段 (Klenow fragment)： E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I 的5-3聚合酶和3-5外切酶活性， Klenow片段

24、是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 Sanger（双脱氧非）DNA测序中使用Klenow片段优于全酶？最好使用没有校对活性的酶？DNA聚合酶I的功能 遗传学分析表明DNA聚合酶I 复制速度慢，持续合成能力差，不是主要的复制酶，主要是参与引物主要是参与引物切成或切成或DNA的损伤修复的损伤修复 （2）. 大肠杆菌的DNA聚合酶 53 聚合酶活性 35 外切酶活性 无 53 外切酶活性 它只是在无pol I及pol 的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在损伤修复中有特殊作用可能在损伤修复中有特殊作用。在在DNA聚合酶聚合酶 I活性低的细菌中发现活性低的细菌中发现,

25、,多多亚基亚基 (3).大肠杆菌的DNA聚合酶 结构特点：结构特点：含含锌锌原原子子 由10种亚基组成不对称异源二聚体异源二聚体。 核心酶核心酶（） 亚基亚基：53 聚合酶活性 亚基亚基：3 5外切酶活性和 碱基选择功能，是复制保真性所必需 亚基亚基:可能起组装作用 亚基亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动,维持进行性 - -复合物复合物：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性EpsilonThetaDNA聚合酶全酶功能：原核生物复制延长中功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的真正起催化作用的酶酶大肠杆菌的三种DNA聚合酶小节催化DNA聚合，主要复制酶参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物

26、、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数-+5 外切酶活性+ 5外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol I突变后的致死性突变后的致死性 可能可能 ？ 可能可能P414（4）大肠杆菌DNA聚合酶和. 新近发现的DNA聚合酶和，参与易错链的修复。 pol IV: (encoded by dinB gene) a) SOS repair enzyme of damaged DNApol V: (encoded by umuD2C gene) a) SOS repair enzyme of damaged DNA 连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻 DN

27、A 链链5 -P末端，形末端，形成磷成磷酸二酯键，从而把两段相邻的酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。链连接成完整的链。反应需要提供能量反应需要提供能量 能量：能量：细菌的连接酶利用细菌的连接酶利用NAD+。 能量：能量：动物和噬菌体的连接酶利用动物和噬菌体的连接酶利用ATPP4173. DNA连接酶（DNA ligase） 酶酶ATP(或或NAD+) +酶酶Connect two adjacent ssDNA strands by joining the 3-OH of one DNA strand to the 5-P of another DNA strand. DNA连接

28、酶过程连接酶过程 P417共价催化共价催化共价的共价的酶酶- -AMP中间物中间物The reaction catalyzed by DNA ligase (1) NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的氨基上形成共价的酶共价的酶-AMP中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸； (2) 将酶-腺苷酸中间物上的AMP再转移到DNA的5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸; (3) 被激活的5-磷酰基端可以和DNA的3-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 细菌细菌的连接酶的连接酶只能连接碱基只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口互补基础上

29、双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。若DNA两股都有单链切口，只要缺口前后碱基互补也可连接 DNA连接酶在复制、DNA修复、修复、 重组、剪接中均起缝合重组、剪接中均起缝合缺口作用，是重要的工具酶之缺口作用，是重要的工具酶之一一。 DNA连接酶 4. 引物酶引物酶 (primerase)（P419） 前导链只需要一个引物，滞后链需要多个引物前导链只需要一个引物，滞后链需要多个引物引物为一小段引物为一小段RNA 引物酶引物酶 (primerase) DNA聚合酶不能发动新链的起始，只能催化链的延伸-DNA合成需要引物，复制的引物为一小段复制的引物为一小段RNA,冈崎片冈崎片断

30、的断的5末端连接有末端连接有小段小段RNA做引物做引物,以提供自由的以提供自由的3-OH，使子代使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。 (1) DNA合成除需要dNTP外，还需要(NTP)-引物引物需要需要，引物为引物为RNA (2) DNA复制需RNA聚合酶聚合酶-（引物合成酶）引物合成酶）, ,一种依赖DNA的RNA聚合酶引物酶 引物酶对 RNA聚合酶抑制剂不敏感，对利福平不敏感 引物酶, 本身无活性, 需组装成引发体才能催化RNA引 物的合成。大肠杆菌的引物酶：Dna G 合成引物50-100nt（长）真核生物的引物酶：DNA聚合酶a 合成引物10nt左右 DNA复制为什么要用引物

31、？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？为什么引物为RNA?） 从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的3， 5，校对功能难发挥作用。 为什么需要引物5. DNA复制的拓扑异构性质UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion 天然天然DNA存在着存在着负超螺旋负超螺旋，这对于DNA分子的解旋非常由利。但随着复制的进行，复制叉前方的亲代DNA会形成正超螺旋，然会积累巨大的张力，这种张力主要是通过DNA拓扑异构酶拓扑异构酶作用消除的作用消除的。P419 DNA复制的拓扑

32、异构性质拓扑异构酶拓扑异构酶:(与转录有关与转录有关) 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。每一次催化作用可消除一个负超螺旋，L值增加1. 反应不需ATP拓扑异构酶拓扑异构酶:(:(与复制有关与复制有关) ) 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子引入负超螺引入负超螺旋状态。每次催化作用使L减少2，又称促旋酶。（DNA topoisomerase）Type I topoisomerases共价催化共价催化Type I topoisomerases共价催化共价催化细菌中的旋转酶细菌

33、中的旋转酶 细菌中称为旋转酶（gyrase)，属于拓扑异构酶引入负超螺旋状态引入负超螺旋状态 Topoisomerases as drug targets: Because dividing cells require greater topoisomerase activity due to increased DNA synthesis, topoisomerase inhibitors areused as chemotherapeutic agents. Camptothecin(喜树碱喜树碱 )- Topo I inhibitor Doxorubicin(阿霉素或多柔比星阿霉素或多柔

34、比星)- Topo II inhibitor These drugs act by stablilzing the DNA-Topoisomerase complex.Also, some antibiotics are inhibitors of the bacterial-specific toposisomerase DNA gyrase e.g. ciprofloxacin喹诺酮类喹诺酮类 杀菌与抗癌杀菌与抗癌6. DNA解螺旋酶（解旋酶，解链酶解链酶） 解链酶解链酶依赖于单链依赖于单链DNA，对，对单链单链DNA亲和力强亲和力强 解旋过程消耗解旋过程消耗ATP：2ATP/bp；具有A

35、TPase活性 DnaB 蛋白在后随链模板沿蛋白在后随链模板沿53移动； Rep蛋白或蛋白或Pri A 蛋白沿前导链模板 35移动 DNA解螺旋酶（解旋酶解旋酶）不是拓扑异构酶，细菌中拓扑异构酶称为旋转酶旋转酶P4217. 单链DNA结合蛋白 四聚体的蛋白四聚体的蛋白； 与DNA单链发生结合； 结合具有协同效应 稳定DNA解链后 的单链状态，并保 护核酸不被降解。 使DNA的Tm下降真核生物中为真核生物中为Rp-A缺失会致死 Single Strand DNA Banding Protein (SSB)P421 四、原核生物DNA复制的过程复制过程分为：复制过程分为：起始起始，延伸延伸，终止终

36、止三个基本步骤三个基本步骤P421( (一一).). DNA复制的起始复制的起始( initiation) E.coli的复制起点的复制起点OriC是决定和控制是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。染色体复制的唯一片段。大肠杆菌的复制起点大肠杆菌的复制起点（OriC） E. coli 复制起始点oriC的序列特征 E.coli的复制起点的复制起点OriC中中有二个复制必需区域有二个复制必需区域： 4个是9bp重复序列重复序列，能与起始蛋白能与起始蛋白Dna A特异结合，对于特异结合，对于DNA复复制的起始十分重要；制的起始十分重要；3个是个连续出现的个是个连续出现的13bp序列，序列，

37、富含富含A和和T，有利于双螺旋，有利于双螺旋DNA局部解旋局部解旋并暴露两条复制模板链并暴露两条复制模板链。 富含富含A和和T原核生物原核生物DNA复制起始的相关蛋白质复制起始的相关蛋白质蛋白蛋白功功 能能曾用名曾用名DnaA辨认复制起点辨认复制起点 DnaB结合于结合于DnaA, 提供解旋酶活性提供解旋酶活性解螺旋酶解螺旋酶DnaC与与DnaB形成复合体形成复合体 DnaG合成引物合成引物 引物酶引物酶 HU刺激起始，促进复合体形成刺激起始，促进复合体形成 Gyrase解除正超螺旋，引入负超螺旋解除正超螺旋，引入负超螺旋 旋转酶旋转酶 SSB稳定单链稳定单链DNA单链结合蛋白单链结合蛋白P4

38、22DNA复制的起始Dna BDna GDna C引发体引发体( Dna B+ Dna G)+ATPHU前引发复合物前引发复合物负超螺旋负超螺旋DNA复制的起始复制起始消耗复制起始消耗ATP复制的起始 复制的起始，复制的起始，要求要求DNA呈负超螺旋呈负超螺旋，这是因为DnaA只能与负超螺旋的DNA相结合，负超螺旋比正超螺旋有更好的负超螺旋比正超螺旋有更好的模版作用。模版作用。 复制的起始，复制的起始，要求起点附近的基因处于转录状态，要求起点附近的基因处于转录状态，RNA聚合酶对复制起始的作用，可能是因为其在起始点附近合成一段RNA，形成RNA突环，影响起点的结构，因而有利于DnaA的作用 研

39、究发现大肠杆菌研究发现大肠杆菌DNA复制唯一一个受到调节的阶段为复制唯一一个受到调节的阶段为起始阶段，起始阶段，DNA的甲基化与细菌质膜的的作用可以影响复制的甲基化与细菌质膜的的作用可以影响复制起始的时间起始的时间，DNA复制的发动与DNA甲基化甲基化和细菌质膜有关。 大肠杆菌复制起点叫ori C，由245bp构成，在ori C中有11个含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使该序列中的A第6位N甲基化。 细菌细菌DNA的复制调控发生在起始阶段P422 细菌细菌DNA的复制调控发生在起始阶段oriC 的的11个回文序列个回文序列 半甲基化半甲基化DNA不启动复制，因为因为oriC与膜

40、结合与膜结合DNA全部复制完并全部复制完并延迟一定时间后，延迟一定时间后，子链子链DNA被甲基化被甲基化新一轮复制新一轮复制 2. 复制的延伸DNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶III引物引物引物引物引物引物前导链：前导链：DNA旋转酶，解螺旋酶旋转酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶聚合酶，焦磷酸酶焦磷酸酶 复制的延伸 前导链前导链 (leading strand):以一条链(3 5)为模板时,子代链的合成方向是5 3, 由引物酶在原点合成一条短RNA链，DNA多聚酶III结合于引物并加接脱氧核糖核苷酸残基 一旦合成开始,前导链的合成便连续地进行,紧跟着复制叉移动

41、,合成是连续的. 随后链随后链 (lagging strand): 以另一条亲代链(5 3)为模板时,子代链的合成方向5 3滞后链的合成是不连续的以短的冈崎片断的形式完成的,每合成一个冈崎片段冈崎片段都需起始一次, 由引物酶合成一个引物引物. 前导链前导链合成一个引物,滞后链滞后链则合成许多冈崎片段的引物。在同一复制叉上，引物的合成前导链早于滞后链前导链早于滞后链。引物引物 是短链RNA。（体外为PCR中DNA) 长度一般：原核生物, 10-60 bp（长） 真核生物, 2-10 bp(哺乳动物) 前导链引物长于长于滞后链冈崎片段引物 合成方向是53方向。 提供的3-OH，可在DNA-pol催

42、化下，利用dNTP 生成磷酸二酯键。后随链的模板在全酶上绕转180.形成一个小环 原核同一个同一个DNA聚合酶III以二聚体形式在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。引发体引发体(primosome)与引物合成与引物合成 解链酶 Dna B有两个功能,其一是解螺旋酶解螺旋酶;另一是活化引物合成酶（Dna G）,与Dna G引物合成酶构成一个基本功能单位,称为引发体引发体（Dna B+ Dna G），合成引物。在某些噬菌体DNA的复制过程中,引发体还包括一些辅助蛋白。P423DNA复制的延伸复制的延伸 引发体引发体方向移动（与引物或冈崎片段合成的方向正好相反相反，而与复制叉移动的复制叉移动

43、的方向相同方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成冈崎片段的连接 冈崎片段的连接冈崎片段的连接: 在DNA聚合酶聚合酶的催化下, 除去RNA引物, 同时催化DNA片段继续延长至另一DNA片段的5端，后在连接酶的催化下连接成完整的DNA 分子。 123冈崎片段的连接冈崎片段的连接切口平移DNA 连接连接酶酶 DNApol IDNApol III DNApol III DNApol IDNA 连接连接酶酶DNA切口平移所用的酶为（ ）。 A、Klenow酶， B、Taq酶， C、DNA聚合酶I D、DNA连接酶Nick Translation（自学）切口平移中国科学院中国科学院0606年

44、年 拓扑异构酶拓扑异构酶细菌领头链和细菌领头链和随从链的延长差异随从链的延长差异前导链：前导链：DNA旋转酶，旋转酶，解螺旋酶解螺旋酶，SSB，DNA聚合聚合酶酶，焦磷酸酶焦磷酸酶细菌领头链和随从链的延长差异 前导链前导链 滞后链滞后链 前 体dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTPNTP: ATP, GTP, CTP, UTP 酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶，焦磷酸酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶，焦磷酸酶，引物酶引物酶，DNA聚合酶，DNA连接

45、酶和连接酶和NAD+复制延伸过程中的各种原料、酶或蛋白质因子) 复制体(replisome) 复制体：复制体：是在复制叉附近与DNA复制有关的酶和蛋白质因子，他们在复制叉上形成离散的复合物,彼此配合,进行高度精确的复制,这种结构称为复制体 (DNA pol二聚体、引发体和DnaB等)复制体的基本活动包括：复制体的基本活动包括：1）双链的解开；2）RNA引物的合成；3）DNA链的延长；4）切除RNA引物，填补 缺口，连接DNA片段；5）切除和修复错配碱基。P4213. E. coli DNA合成的终止 现已发现有两个现已发现有两个终止区域终止区域 （terE,D,A 和ter C,B,F）， 位

46、于相遇点的另一侧位于相遇点的另一侧100Kb 处。每一终止顺序对某一方处。每一终止顺序对某一方 向移动的复制叉来说是特异的向移动的复制叉来说是特异的。 终止需要终止需要Tus(36kD)， Tus能识别ter保守顺序， 并阻止复制叉继续前进。 ter-Tus复合物可能通过 抑制螺旋酶螺旋酶来实行终止E. coli DNA合成的终止合成的终止 The two newly synthesized circular chromosomal DNAs are topologically interlinked (catenated) and is finally separated by theact

47、ion of a Type II opoisomerases. 最后还有最后还有50-100bp通过修复方式填补通过修复方式填补拓扑异构酶拓扑异构酶( termination)思考题1. 在DNA复制过程中，两条新链的合成为何一条链是连续复制，另一条链是间断复制？并比较两条新链合成过程的不同点。 天津医科大学2006生物化学2. 简述参与DNA复制的酶及基本过程 复旦大学2003年考研生物化学3. 细胞DNA复制是半不连续的，这是因为： A. DNA 聚合酶只能从35 合成DNA链 B. 模版双链是反平行的 C. DNA 聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基 D. DNA 酶法合成是个自发过程

48、南开大学2006年生物化学 思考题 4. 以下哪个过程不需要以下哪个过程不需要DNA连接酶连接酶? ? (A) DNA复制 (B) DNA修复 (C) DNA重组 (D) 制备重组DNA (E) DNA修饰。 5 需要以需要以RNA为引物的是为引物的是: : (A) DNA复制 (B) RNA转录 (C) 转录 (D) 蛋自质合成 (E) RNA复制 华东师范大学2006生物化学考研 6. 叙述DNA聚合酶I在大肠杆菌细胞DNA复制中的功能，并 介绍这个酶在生物技术中的应用。 南开大学2006年生物化学 7. 原核生物DNA复制的过程 中国农业大学2011年生物化学思考题8. 关于关于DNA复

49、制的叙述哪一项论述是错误的复制的叙述哪一项论述是错误的? ? ( ) A有DNA指导的RNA聚酶参加，B有RNA指导的DNA聚合酶参加，C. 为半保留复制 D. 有DNA指导的DNA聚合酶参加 山东大学2001生物化学9. 在一个复制叉之中，以下哪一种蛋白质的数量最多在一个复制叉之中，以下哪一种蛋白质的数量最多?( ) （A）DNA聚合酶 （B）引发酶 （C）SSB （D）DNA解链酶 （E） DNA拓扑异构酶 华东师范大学2007年 思考题思考题10、打开打开DNA超螺旋的酶或蛋白质是（超螺旋的酶或蛋白质是（ ） A、DNA解螺旋酶 B、单连结合蛋白 C、DNA旋转酶 D、DNA聚合酶1 E

50、、DNA聚合酶2 苏州大学苏州大学20062006年年11、DNA 连接酶连接酶 在下列那一过程中不需要在下列那一过程中不需要？A、 DNA复制 B、 制备重组DNA C、 DNA 修复 D 、DNA断裂 厦门大学厦门大学20112011年年12、 山东大学山东大学2015 名词解释名词解释: 滚环复制 判断：判断： 1）.大肠杆菌DNA聚合酶I具 5-3外切酶活性，也可以RNA 为底物。 2）. 基因组DNA复制，先导链引物为DNA，后随链引物为 RNA。 3）. 因所有的DNA聚合酶都按5-3催化链延长，因此推测必定存在一种未发现的酶能 按3-5催化复制叉上第二条链使之延长。思考题 思考题

51、思考题13、大肠杆菌大肠杆菌DNA复制和体外酶促扩增复制和体外酶促扩增DNA的比较。的比较。中国药科大学中国药科大学201320132.、为什么说DNA复制以5-3为模板的是半不连续复制，它如何完成复制过程。2015考研考研827生化回忆版生化回忆版_天津大学天津大学五五 真核生物真核生物DNA复制复制P424 真核生物染色质的基本单位：核小体，核小体真核生物染色质的基本单位：核小体，核小体DNA长长度度200bp左右，真核生物冈崎片段较短的长度左右，真核生物冈崎片段较短的长度200bp左右，左右，相当于一个核小体相当于一个核小体DNA长度长度多起点复制，酵母复制起点多起点复制，酵母复制起点A

52、RS真核生物真核生物DNA复制与原核生物复制与原核生物DNA复制的差异复制的差异(1). 真核生物复制慢真核生物复制慢：原核细胞DNA复制叉移动速度快，细菌复制叉移动速度为50000bp/min，哺乳动物DNA复制叉移动速度慢,约为10003000bp/min。(2). 真核细胞含多个复制子真核细胞含多个复制子，多个复制起点。人平均每个染色体上有1000个复制子，原核细胞DNA中多数只有一个复制子。(3). 真核细胞的复制子在每个细胞周期仅复制一次真核细胞的复制子在每个细胞周期仅复制一次，原核细胞在快速生长时，在DNA复制起点可连续复制多次，(4). 引物和冈崎片段较短引物和冈崎片段较短 (5

53、). 连接酶需连接酶需ATP (6). 端粒的复制端粒的复制 (7). 聚合酶和蛋白质因子不同聚合酶和蛋白质因子不同。真核细胞DNA与组蛋白结合成核小体，原核细胞DNA不存在核小体。P425（1）. Semi-conservative replication（2）. Semi-discontinuous repliction（3）. DNA helicase（4）. RNA priming (5). 校对校对（Proofreading） (6). 单链结合蛋白单链结合蛋白真核生物真核生物DNA复制与原核生物复制与原核生物DNA复制的相同点复制的相同点2.原核生物与真核生物复制的差异2015年东

54、北师范大学（851）生物化学 真核生物的五种DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol 类似类似原核生物原核生物DnaG, primase德尔塔德尔塔伊普西龙伊普西龙在核酸酶切在核酸酶切去引物后，去引物后，补引物缺口补引物缺口合成引物：合成引物：RNA+DNA主要的主要的复制酶复制酶 真核生物的五种DNA聚合酶(1) DNA-pol （核内）: 起始引发，有引物酶引物酶活性。 （DNA-pol+ primase形成紧密的复合物）(2) DNA-pol （核内）: 参与低保真度的复制 。(3) DNA-pol （德尔塔德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶主要酶，有持 续合成DNA链的活性又有校读功

55、能,和组织相容抗原 PCNA)相互作用。(4) DNA-pol （伊普西龙）（核内）:修复损伤DNA 和填补引填补引 物空隙物空隙的功能的功能。(5) DNA-pol （线粒体内）:在线粒体DNA复制中起作用。 DNA复制的起始复制的起始起始起始DNA德尔塔德尔塔 真核生物DNA复制的过程1、DNA Pol 形成引物（RNA + DNA）2、两个DNA Pol （德尔塔德尔塔）或一个DNA Pol 与一个DNA-pol （伊普西龙）在引物后延长DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除冈崎片段RNA引物的4. DNA聚合酶填补缺口，类似细菌-DNA-pol5. DNA连接酶进行连接

56、反应，需要ATP供能。DNA-pol （德尔塔德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶主要酶起作用。伊普西龙伊普西龙真核生物引物的切除和补缺口FEN1又写为MF-1 pol (伊普西龙伊普西龙)真核和原核细胞的DNA复制比较 功能功能 E.coli 人人 复制酶复制酶 Pol的的 全酶全酶 Pol 进行性因子进行性因子 夹子夹子 PCNA 定位因子定位因子 复合体复合体 RF-C SSB 引物酶引物酶 DnaG Pol -引发酶引发酶 去除引物的酶去除引物的酶 DNA聚合酶聚合酶1 RNaseH1和和MF-1 后随连修复酶后随连修复酶 DNA聚合酶聚合酶1和和 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连接酶

57、 DNA连接酶连接酶 1 解旋酶解旋酶 DnaB T抗原抗原 消除拓扑张力酶消除拓扑张力酶 旋转酶旋转酶 拓扑异构酶拓扑异构酶 单链结合蛋白单链结合蛋白 SSB RP-A 起始蛋白起始蛋白 DnaA T抗原抗原注：MF-1又写为FEN1P426环状环状DNA 大肠杆菌能否完整复制真核生物链状染色体？线状线状DNA: 滞后链复制不完整5端 DNA复制的末端复制的末端端粒和端粒酶端粒和端粒酶 端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体。端粒由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人TTAGGG，四膜虫为TTGGGG），富含G。端粒也被科学家称作“生命时钟”。 端粒和端粒酶端粒和端粒

58、酶 人类端粒酶含三部分人类端粒酶含三部分： （端粒酶端粒酶RNA） 、（端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白）、（端粒酶端粒酶逆转逆转录酶）录酶），除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外, 大多数正常人体细胞正常人体细胞失去端粒酶活性失去端粒酶活性。恶性肿瘤细胞中, 85%90%端粒酶强阳性。端粒酶强阳性。端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点. . 原核生物没有端粒酶原核生物没有端粒酶端粒酶(telomerase):是一种反转录酶, 修补端粒序列 由由RNA（做模版）（做模版）和蛋和蛋白质白质（逆转录酶）（逆转录酶）构成的一构成的一种核糖核蛋白复合体，维持种核糖核蛋白复合

59、体，维持端粒的长度。端粒的长度。 端端 粒粒 酶酶端粒的形成端粒的形成六、 DNA复制的忠实性机制（补充补充） DNA复制的差错率只有复制的差错率只有10-810-101. DNA聚合酶的选择作用选择作用（根据碱基配对规律，但碱基有烯 醇式和酮式两种构象）(104-105)2. DNA聚合酶本身具有校正功能校正功能(35外切酶活性)(102-103) 加入错配碱基后合成速率下降，为校对修复留出时间：动力学校对3. 细胞内有错配修复等损伤修复系统损伤修复系统4. 细胞维持dNTP的平衡水平的平衡水平；5. RNA作为合成引物（起始合成时易出错）；前导链和滞后链的忠实性程度往往不同DNA复制时，新

60、链合成都遵循碱基配对原则！(102-103)1. 哪些机制保证了DNA复制的准确性？为什么生物体内转录的准确性没有DNA复制准确性高？ 中国农业大学2012年生物化学2、判断：判断：与原核生物不同，几乎所有的真核细胞都发现有 端聚酶。2013年中山大学3. 端粒酶是：端粒酶是：A、限制性内切酶 B、DNA聚合酶 C、RNA聚合酶 D、肽酰基转移酶 厦门大学厦门大学20112011年招年招思考题思考题南开大学20102011年中国海洋大学年中国海洋大学6. 判断：所有的冈崎片段都是从5-3方向合成，在3端延长。 厦门大学厦门大学20112011年招年招7、下列与DNA解链无关的是？ A、单链DN