谷氨酸生产菌的选育

1、谷氨酸生产菌的选育 生化121 22号n谷氨酸生产菌的选育方法，主要是采用常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。诱变育种n利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随即突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。n诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA结构用适宜的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。诱变育种的基本流程n合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验谷氨酸生产菌的诱变育种流程n以菌株AS

2、L299为出发菌株，采用复合诱变剂进行诱变n在诱变育种实践中，为了获得协同效应，常常采取诱变剂进行复合处理，可以是两种或多种诱变剂的先后使用，或是同一种诱变剂的重复使用，或是两种或多种诱变剂的同时使用。n出发菌株ASL299菌悬液制备硫酸二乙酯诱变单氟乙酸平板筛选高糖平板筛选高谷氨酸平板筛选摇瓶筛选DES突变株原生质体制备紫外线诱变原生质体再生香豆素和氯化锂平板筛选谷氨酸为唯一碳源平板筛选摇瓶筛选UV突变株稳定性试验生产条件试验谷氨酸菌诱变选育操作步骤n（1）菌悬液的制备 将出发菌株AS1.299斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养8h，离心去清夜，加入7.0缓冲液稀释菌体泥制菌悬液

3、。n（2）硫酸二乙酯诱变 在菌悬液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为1%（体积分数），在电磁搅拌下处理2030分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。n（3）单氟乙酸平板筛选 将诱变的菌悬液涂布在含0.5%单氟乙酸的平板上，在32摄氏度的条件下避光培养3648h,挑取生长良好的菌落。n（4）高糖平板筛选与高谷氨酸平板筛选 将抗单氟乙酸的菌株涂在含25%葡萄糖的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌落，可得到耐高糖菌株。然后，将耐高糖菌株涂在含20%谷氨酸的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌株，即得到耐高谷氨酸菌株。n（5）摇瓶筛选 将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸

4、产量，选出谷氨酸高产菌株。n(6)原生质体制备 将DES突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3） 个/ml。然后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，最后制成原生质体的高渗悬液。取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏

5、度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率=酶解前的菌落数霉解后的菌落数酶解前的菌落数n(7)原生质体的紫外线诱变 取5ml原生质体悬液放入已灭菌的9cm的培养皿中，采用15W，波长为253.7nm左右的紫外线灯进行照射，照射距离为30cm，照射时间为20-40h。照射过程采用电磁搅拌以使照射均匀。n(8)原生质体再生 紫外线诱变后，用高渗稳定液对原生质体悬液进行适当稀释，吸取0.1ml涂布于下层固定体再生培养基上，再加入上层固体再生培养基，轻微摇匀，双层平板法于28摄氏度培养72h。取1ml原生质体悬液，用高渗稳定液稀释后涂布于下层固体再生培养基上恒温28摄氏度培养72h。更具在平板上形成的菌落数计算原生质体再生率，原生质体再生率=%100酶解后的菌落数酶解前的菌落数酶解后的菌落数再生的菌落数n（9）香豆素和氯化锂平板筛选 挑取再生菌落涂在0.15%香豆素和0.5氯化锂的平板上，在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取生长良好的菌落。n（10）谷氨酸唯一碳源平板筛选 用牙签法将抗维生素P类衍生物菌株接到以谷氨酸为唯一碳源平板上，在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取省长微弱或不声张的菌株，即为不利用谷氨酸的菌落。n（11）摇瓶筛选与稳定性试验 经谷氨酸为唯一碳源平板筛选后，