放线菌新种分类鉴定(1)

1、.1放线菌新种分离鉴定放线菌新种分离鉴定1实验目的实验目的2实验方法实验方法3实验结果实验结果4总结总结.21、实验目的实验目的 本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴定，生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴定，证明其是以前从未发现的新种。证明其是以前从未发现的新种。.32、实验方法实验方法2.1 分离方法分离方法2.3 鉴定方法鉴定方法2.2 16SrRNA基因序列测定基因序列测定.42.1 分离方法分离方法近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液

2、相结合的分离方法、再水化-离心离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用于稀有放线菌选择性分离的方法。于稀有放线菌选择性分离的方法。.52.2 16SrRNA基因序列测定基因序列测定放线菌基因组的提取放线菌基因组的提取16SrRNA16SrRNA基因扩增基因扩增胶回收胶回收连接连接转化转化测序研究测序研究.6A电镜观察电镜观察B培养特征培养特征C生理生化特征生理生化特征2.3.1 表观特征表观特征.7A. 电镜电镜取菌体后取菌体后,3%戊二醛固定戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。磷酸缓冲液漂洗。酒精梯度脱水，在酒精

3、梯度脱水，在30%、50、70、80%、100依次脱依次脱水，其中水，其中100酒精酒精2次，每次次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，乙酸异戊脂置换，50%一次，一次，100%两次。两次。Eiko公司公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司公司IB-3型离子镀金仪喷金镀膜。型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司公司JSM-840扫描电镜观察。扫描电镜观察。.8B. 培养特征培养特征参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征测定。所采用的标准培养基进行培养特征测定。所用培养基有所用

4、培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，平板接种，28培养培养7，14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶性色素。生长情况及可溶性色素。.9C. 生理生化实验生理生化实验生理生化特性的测定主要包括生理生化特性的测定主要包括:pH、盐浓度和温度耐受性，、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶明胶液化，淀粉水解，脲酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑的产生，黑色素的产生，唯一碳、氮源利用

5、等试验。色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。.10a. pH、盐浓度和温度耐受性、盐浓度和温度耐受性upH耐受实验耐受实验在高氏一号培养基中分别加入在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，缓冲液，空白培养基作阴性对照，28培养，每周观察一次，四周结束，重复培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。次。u温度耐受实验温度耐受实验将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4、10 、16 、20 、28、37、45培养，每周观察一次，四周结束，重复培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。次。u盐耐受实验盐耐受实验高氏一号培养基内加入不同浓度的高氏一号

6、培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28培养，每周观察一次，四周结束，重复培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。次。.11b. 明胶液化明胶液化取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于对照。于28C培养箱中培养。培养箱中培养。培养培养2、7、10、14和和30天的试管，放入天的试管，放入4C冰箱或置于冰箱或置于冷水中冷水中30min，然后进行观察。，然后进行观察。如明胶凝块部分或全部变为可流通的如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体液体，则明胶水解，则明胶水解阳性阳性。如明胶凝块呈如明胶

7、凝块呈固体固体，则明胶水解，则明胶水解阴性阴性。若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。.12c. 淀粉水解淀粉水解将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色，菌落四周若不变色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色不变色，表示淀粉水解表示淀粉水解阴性阴性；若变成；若变成透明无色透明无色则为

8、则为阳性阳性，说明，说明产生淀粉酶水解淀粉。产生淀粉酶水解淀粉。.13d. 脲酶的产生脲酶的产生e. 牛奶凝固与胨化牛奶凝固与胨化将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论

9、底物尿素是否存为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为为7.0。挑取挑取1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养培养14d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红粉红色为阳性色为阳性。.14将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。取样测定。每株菌作复本，另两管作对

10、照。培养液中加入格里氏试剂培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现液各一滴，如呈现粉红色、粉红色、玫瑰红色玫瑰红色，表明硝酸盐还原，表明硝酸盐还原阳性阳性，如无红色出现，则加，如无红色出现，则加1，2滴二苯胺试剂，如呈滴二苯胺试剂，如呈蓝色蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，表示培养液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐还原属硝酸盐还原属阴性阴性，若，若不呈蓝色不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质，仍按都已还原成其他物质，仍按阳性阳性结果处理。结果处理。f. 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验.15g. H2S的产生的产生某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢

11、某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用生成生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。h. 黑色素的产生黑色素的产生将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和和 14 d 观观察结果，培养基被染成察结果，培养基被染成褐色或者黑色褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。即说明该菌产生黑色素。.16i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）板）碳源：碳源：D-葡萄糖，

12、蔗糖，葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，树胶醛糖，D-果糖，果糖，D-木糖，鼠李糖，木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。甘露醇，纤维素。不加碳源的基础培养基作为阴性对照。不加碳源的基础培养基作为阴性对照。氮源氮源: KNO3，NaNO2，尿素，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸，酸， DL-天冬氨酸，天冬氨酸，L-甲硫氨酸，甲硫氨酸，DL-丙氨酸，丙氨酸，L-精氨酸，精氨酸，L(+)-谷氨谷氨酸，甘氨酸，酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。苯丙氨酸，腺嘌呤。不同氮源按不同氮源按0.5%的浓度加入，培的浓度加入，培15天后，将各种氮源上

13、的生长状况天后，将各种氮源上的生长状况与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。.17A细胞壁化学组分细胞壁化学组分B磷酸类脂测定磷酸类脂测定C甲基萘醌测定甲基萘醌测定D脂肪酸测定脂肪酸测定2.3.2 化学分类化学分类.18A.细胞壁化学组分细胞壁化学组分放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖分子中肽链第分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。Lechevalier等（等（1976）根据

14、放线菌细胞壁的化学组）根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群个主要类群和和4个糖型。个糖型。.19胞壁类型胞壁类型主要组成主要组成代表属代表属IL,L-DAP，甘氨酸，甘氨酸SterptomycesIIMeso-DAP，甘氨酸，甘氨酸MicromonosporaIIIMeso-DAPActinomaduraIVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖，阿拉伯糖，半乳糖NocardiaV赖氨酸，鸟氨酸赖氨酸，鸟氨酸ActinomycesVI赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）OerskoviaVIIDAB，甘氨酸，甘氨酸

15、AgromycesVIII鸟氨酸鸟氨酸BifidobacteriumIXMeso-DAP， 多种氨基酸多种氨基酸Mycoplana放线菌细胞壁的主要构成（放线菌细胞壁的主要构成（Lechevalier，1976）.20糖类型糖类型主要成分主要成分代表属、种代表属、种A阿拉伯糖，半乳糖阿拉伯糖，半乳糖NocardiaB马杜拉糖马杜拉糖ActinomaduraC无特征性糖无特征性糖StreptomycesD木糖，阿拉伯糖木糖，阿拉伯糖MicromonosporaE半乳糖半乳糖Kutzneria viridogriseum放线菌全细胞的主要糖类型（放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier，1

16、976）.21全细胞全细胞TLC分分析实验流程：析实验流程：.22磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。用于分类指征的磷酸类脂只有五种：用于分类指征的磷酸类脂只有五种：磷脂酰乙醇胺（磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）磷脂酰甲基乙醇胺（磷脂酰甲基

17、乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）磷脂酰胆碱（磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC）磷脂酰甘油（磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG）含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu）B. 磷酸类脂测定磷酸类脂测定.23称取称取1g湿菌体于带螺口的湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。离心管中。加入加入15ml甲醇。甲醇。100水浴水浴10 min，自然冷却。，

18、自然冷却。 加入加入10 ml氯仿和氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀用力摇匀10 min，静止可看到分层。，静止可看到分层。 8000 rpm，离心，离心10 min。到入分液漏斗静止分层，取下层。到入分液漏斗静止分层，取下层。30-40旋转蒸干。旋转蒸干。分两次各加入分两次各加入200l氯仿氯仿/甲醇（甲醇（2:1）冲洗器壁。）冲洗器壁。 液体移入液体移入EP管（约管（约100-200l）,8000 rpm，离心，离心10 min，去沉淀。，去沉淀。4保存备用。保存备用。 细胞磷脂的提取细胞磷脂的提取.24实验流程：实验流程：.25C. 甲基萘醌测定甲基萘醌测定大多数细菌含有甲基

19、萘醌或泛醌，或两者均有。包大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱和度变化相当大，多为部分饱和，含有和度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯个异戊烯单位。单位。放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。.26放线菌目中甲基萘醌类型放线菌目中甲基萘醌类型类型类型萘醌种类萘醌种类Eubacteria（异戊烯单位无氢化）（异戊烯单位无氢化）IaMK-7Bmk-9Mycob

20、acterium（主要是（主要是8或或9个异戊烯个异戊烯单位上被单位上被2或或4个氢化）个氢化）IIaMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（4氢化的多烯萘醌）氢化的多烯萘醌）IIIaMK-8(H4), MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一链长，但氢（具有同一链长，但氢饱和度不同的萘醌）饱和度不同的萘醌）IVaMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6).27菌体的收集制备菌

21、体的收集制备待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于水洗涤两次，菌体于-80冷冻冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体体，冻干菌体4干燥器保存备用。干燥器保存备用。醌的提取及纯化醌的提取及纯化.28D. 脂肪酸测定脂肪酸测定放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具有分类学意义，是一项重要的分类特征。有分类学意义，是一项重要的分类特征。脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属3种类型：种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂

22、形式的脂肪酸。直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对含量因菌龄和培养条件的不同而异。含量因菌龄和培养条件的不同而异。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析可为种和亚种分类提供有用的基本资料。析可为种和亚种分类提供有用的基本资料。.292.2.3 基因型分类基因型分类AG+C%含量分析含量分析BDNA-DNA分子杂交分子杂交C16srRNA基因序列分析及进化树的构建基因序列分析及进化树的构建.30A. G+C%含量分析含量

23、分析DNA 碱基组成比例（碱基组成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一，）是十分典型的基因指征之一，一般认为一般认为 G+C mol%在种内相差不会超过在种内相差不会超过 3%，在属内不会超过，在属内不会超过 10%。大量分析结果表明：放线菌属于高大量分析结果表明：放线菌属于高 GC 含量的微生物，并且含量的微生物，并且 G+C%变化范围小，最多不会超过变化范围小，最多不会超过 30%。由于。由于 G+C%在不同物在不同物种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一个，常常作为属的分类鉴定标准之一。个，常常作为属的

24、分类鉴定标准之一。.31HPLC实验：实验：实验条件：实验条件：1.0ml/min 37C柱子：柱子：C18反相柱反相柱溶剂：溶剂：12%甲醇甲醇 20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1） 20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）配制：）配制：三乙胺（三乙胺（99%）用水稀释，用）用水稀释，用85%磷酸调磷酸调pH至至5.1，即，即0.5M磷酸三乙胺磷酸三乙胺40ml 0.5M磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）与）与750ml glass-distilled water混合，再混合，再加入加入120mlHPLC-grade甲醇，再加入水至总体积为甲醇，再加入水至总体积为1L。不用柱子时，流速减至不用柱子时，流速减至0.1ml/min当仪器超过当仪器超过3天不使用时，柱子先用水清洗，再用天不使用时，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。甲醇清洗。.32B. DNA-DNA分子杂交分子杂交DNA-DNA分子杂交可以在基因组水平上研究微生物间的分子杂交可以在基因组水平上研究微生物间的区别与联系，用于种水平的分类学研究和新种的确立。区别与联系，用于种水平的分类学研究和新种的确立。1987 年，国际系统细菌学委员会规定：年，国际系统细菌学委员会规定： DNA 同源