膜蛋白的提取与分离

1、膜蛋白的提取与别离膜蛋白的别离一、简介： 1细胞质膜资料1895年,0 vert on从研究细胞透性得出细胞膜由连续的脂类物质组成 。1925年 Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总 面积，提出： 细胞膜是由双层脂分子组成 。1935年 Danielli&Davson ：从测定膜的外表张力得出细胞膜的 三明治 结构模型 ，即蛋白质脂 -蛋白质。1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出单位膜模型，将膜的分子 结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5( 亮)+2 暗 =7.5 细胞质膜的主要功能概括如下：( 1 )为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境

2、 ;(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中 伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反响高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接 ; 质膜参与形成具有不同功能的细胞外表特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白别离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大 类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜外表的蛋 白质分子或脂分子结合，因此只要

3、改变溶液的离子强度甚至提高温度 就可以从膜上别离下来，膜结构并不被破坏。(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可别离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。附注：使用分级抽提方法获得的膜蛋白中只有很少一局部是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个 瓶颈，不管采用2D技术也好，ICAT乃至 proein microarray都 还不能有效解决这一问题。二、蛋白抽提 谈及蛋白别离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、 等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶 解法有时这些方

4、法常常组合到一起对特定的物质进行别离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解 度也各不相同 .根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取， 分为水溶液提取和有机溶剂提取 . 但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是 嵌在膜中的，水溶性不好，根本方法就是用不同的离心速度去掉胞质 蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白别离纯化的重 要步骤是选择适当的增溶用外表活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS一种离子去污剂，Emulgen和Lubrol等外表活性剂。1、别离膜蛋白的方法原那么性 ：1先别离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超

5、声破碎 法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离 心得到含有膜蛋白的粗组分。 例如： michael11 液氮研磨组织，加 入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集 37% 与41%间的成分，即为质膜局部。裂解即可收集膜蛋白 2用特殊的去污剂选择性的别离。从膜上提取蛋白有许多困难 .在多 数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定 . 去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效 率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤 .虽然许多膜 蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去 垢剂.这常常会引

6、起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不 是一个问题 .如果不是用于测序的， 可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水 珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中， 都介绍有许多种不同的 可用来溶解膜蛋白的去垢剂 . 然而，他们并不是普遍适用的 .在设计膜蛋 白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100 在280nm 处有吸收， 如果某蛋白质的测试与 280nm 处的吸收有关， 就应 防止使用这类去垢剂 . 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核别离后，再进一步从细胞膜制剂中将所 需的膜蛋白增溶下来 . 这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细 胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、

7、细胞核成分或染色质成分 的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都 比酸溶解法所得到的蛋白 5000Da 要多.一般提取的膜蛋白量往往 只占膜蛋白总量的缺乏 0.1% ，所以充分的膜蛋白的提取， 无疑对于研 究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的 .第二种方法简单，可靠，但有 时含有其他蛋白。一般的都是利用 4度时所有的蛋白质原那么上都溶于 TritonX114 水溶液，在温度超过 20度时，此溶液分为水相和去污相； 此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性 质可提取膜蛋白。3 ) 膜蛋白色谱 (Chromatography of Membrane Prot

8、ein,CMP)CMP+ 别离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂如SDS溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子别 离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团P-端，又具有阳离子钙C-端，与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究CAMP的别离机制发现，样品与SDS结合后在离 子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交 换，从而到达分级别离的目的。层析柱提取 :alomone/参步骤三、4) 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的 蛋白溶解液进行抽提的方法。用 Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解

9、性蛋 白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复 合外表活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶 解的膜蛋白。5) ce ntrifugal protein extracti on离心的CellsTris extraction10min vortex. 40 interval sonificationIcentfifuge10min. 12r000g. 259I一 iIIcytosolpelletIUreafThiourea ejctraotiun10min vort&x, 40 intervals sonicationIcentrifugelOmin.

10、12,0009. 259CIImembrane Fractionpellet原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级胞浆和胞膜之间有清洗的步骤，但是可溶蛋白组分和 膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步用tris抽提 水溶性蛋白和最后一步极难溶蛋白,在操作上也作了简化，总而言之 是一种不错的方法。codegreen6detergent- based :提取时先裂解液裂胞膜选用不同的去污试剂是 关键，梯度离心别离细胞器ER，然后分级抽提方法。例如，去掉细 胞器之后的DEBRI

11、S就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂 胞膜时不溶的局部。总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便 迅速。到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。2、别离膜蛋白的方法操作1别离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A 中，于室温与液氮罐中反复冻融 2次。2 5000 转4 度离心，驱除核及未裂解的细胞。3取上清12000转4度离心 10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B 中。4 12000转4度离心10分钟取沉

12、淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C中提 取后测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。bufferA:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)bufferB:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2别离细胞膜蛋白的方法

13、：1、细胞放在冰上，去除上清，用 pH7。 4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层 细胞两次2、参加 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min3、刮下单层细胞， 4度下10 000g 5min 离心4、溶液37度水浴10min以别离水相和去污剂相，然后37度下2 OOOg离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温， 在按步骤 6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释 到初始体积8、用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂：1、 2%tritonX114:2%T

14、ritonX114 、50mmol/L Tris HClpH7。5、蛋 白酶抑制剂2、缓冲液 A含 0。5mol/LNaCI 的 RIPA buffer3 、 buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)3别离细胞膜蛋白的方法：7M urea 2M thiourea4%chaps2.5%sb3-10 1000000个细胞，可用此 buffer 1ml 。冰浴匀浆。冰上置 30分钟。 4度高速低温离心 30min 。取上清-20保存。4别离组织膜蛋白的方法：1 、取组织，参加 10ml Buffer A 于冰上

15、充分匀浆。2、J6-HC离心机800rpm , 4C离心10min后，所得上清液转入超速离 心管。3、lOOOOOg , 4C离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬， 冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4C 离心 30min 。4、收集所得上清液即为膜组份。Buffer A :蔗糖，5mM Tris-HCl, 120mM KCl, 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。Buffer B: 2

16、0mM HEPES， 10%甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。5别离组织膜蛋白的方法： RIPA1XPBS1%NP40去氧胆酸钠0.1%SDS以下用时参加10mg/ml PMSF 异丙醇终浓度 10ul/ml Aprotinin 30ul/ml 1000mM Sodium Orthovandate 10ul/ml 冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。冰浴匀浆 冰

17、上置 30分钟。4度高速离心 30min ， 20000转低温离心最正确。 取上清-20保存。6别离细菌膜蛋白的方法： 于20ml营养肉汤中过夜培养细菌，37 C, 200rpm。 10000g、20min、4C离心，去上清。 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的 Tris-Mg 缓冲液。 超声波破碎细菌。 3000g , 10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清含有 胞质成分和细菌外被成分 。 超速离心1: 100,000g , 60min , 4C，去除上清胞质成分，收集 细菌外被成分。 用 10ml 含2的 SLS 的 Tris-Mg 缓冲液重悬

18、沉淀物，室温温育20-30min 。 超速离心 II : 70,000g ， 60min ，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清含细胞质膜。重复、两步。 充分吸除上清， 并根据沉淀体积大小用 0.1-0.2 ml 的 ddH2O 重悬沉 淀物。根据公式:蛋白浓度 (mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260 测定外 膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70 C贮存。试剂 Tris-Mg缓冲液10mM Tris-Cl5mM MgCl2,4C保存 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠(SLS)7来源于 Methods Enzymology (1974)1. 取一定量酶处理的细

19、胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保 持完整。由于水与膜的疏水局部之间有反响，因此要精确掌握别离介 质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加 40ml 介质。2 .用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙上下匀浆46次， 每次 5S。3. 过滤匀浆液，150g离心10min，保存上清，沉淀局部参加50山介 质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀局部再参加上 次匀浆的上清液。4 .合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀局部溶于100山介 质，离心 10min ，弃上清，留沉淀。5. 将沉淀局部参加 70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，

20、上 面依次叠加 54%、49%、45% ， 41%， 37%蔗糖溶液各 2、2、5、5、 3份。6. 700kg离心90min，别离介质在之间形成介面。7 .收集d为之间的细胞膜，加30倍的介质以离心10min，洗涤2次。8保存于缓冲液中，用于细胞膜的研究分析8常用的制备粗制质膜组分的方法： 所有操作都在 4摄氏度下进行1 .在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗 组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成 1mm3 大小的碎片，且无可见的血。2. 参加5倍体积比与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研 10-20次，匀浆组织。3匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀4上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。5. 上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。6. 用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度， 10000g 离心20min ，弃上清。7. 用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。8 .粗制的样品可于干冰 /乙醇中速冻，保存于 -80摄氏度。9用特殊的去污剂选择性的别离。 简单，可靠，但有时含有其他蛋白。原理：4度时所有的蛋白质原那么