感受态细胞的制备步骤和原理

1、实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体， 我们需要将购买来的质粒通过转化的 方法导入细 菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的 质粒导入其中，使其繁 殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒 的数量。同时，我们能掌握大肠杆 菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实 验技术方法。实验原理及过程实验步骤1 挑取一个 JM109 单菌落于 3ml LB 无抗生素 ）培养基中， 37C , 180rpm 培 养过 夜。让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。 2 取过夜培养物加入到 40mL LB 无抗生素 ）培养基中， 37C 250rpm 大约小 时。减少

2、达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。 3 取培养物置于 40mL 的灭菌离心管中，冰浴 10min , 4000rpm4 C 离心 10mi n , 弃 上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。 4 菌体重悬于 10mL100mmol/L 冰冷 CaCI2 中，轻吹， 4C 30min , 4000rpm 离心 5min 弃上清。细菌处于0度，CaCI2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源 DNA形成抗DNA 酶的羟基 -钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面 （羟基来源于细胞壁上的糖， 磷

3、 酸来源于 DNA）， 经短时间 420C 热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） 5 菌体重悬于 1mL 100mmol/L 冰冷的CaCI2 中，轻吹，用于转化。 除去所有的 LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以 致大量 细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） 6 取感受态细胞 100uL , 加入 2uLpET-21a 质粒，冰浴 30 min 受体菌：感受 态细胞 1OOuL , 加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照： LCaCI2 溶液 1OOuL , 加入 2 uL 阴 性对照第一个阴性对照是为了验证 LB

4、中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了 验证 CaCI2 溶液和 pET-21a 质粒未被污染。 冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。 7 热激 42 度， 90s【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使 细 胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8 冰浴 2 min9 加入 800 uL 无抗生素的 LB, 37 C 复苏 1h【用 LB 复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表 达抗抗生素的基因 , 只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的 LB 平板上生长。】10 取 100uI 细胞直接在含 50ug/mLCarbenicillin 羧苄西林 ） 的 LB 培养基上铺 平 板，将平皿放置 37 oC 温箱 30min 至液体被吸收。倒置平皿 37 oC 培养过夜， 出现菌落。【这些菌落为转化成功的菌落 , 而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁 边有可能出 现卫星菌落 , 这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素 失效, 长出了转化为成功 的菌落。用羧苄西