终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径

1、终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径    摘 要：目的：探讨葡萄糖和高脂诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用。方法：采用终末糖基化产物、高脂共同诱导内皮细胞凋亡建立模型，并用葛根素进行干预。采用免疫细胞化学法检测Caspase3 阳性细胞数。流式细胞分析仪检测终末糖基化产物及高脂预处理后内皮细胞凋亡百分率。结果：中浓度终末糖基化产物(AGE50ug/mol)以及氧化低密度脂蛋白（ox-LDL50mg/L）36h 作用于人脐静脉内皮细胞与正常水平的内皮细胞相比，凋亡细胞数量显著增加p<0.05，葛根素预处理12h 后显著降

2、低高糖诱导的凋亡率p<0.05。结论：葛根素可以抑制高糖高脂诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,这在防治糖尿病及动脉粥样硬化并发症的过程中起到一定作用。关键词：内皮细胞；凋亡；葛根素细胞凋亡进程中重要的执行者和与细胞凋亡进程密切相关的线粒体属于细胞凋亡的信号转导范畴。caspase 家族作为特异性的死亡信号传导分子是凋亡的执行者，caspase-3 作为凋亡级联中的效应因子被称为“杀手蛋白”。如果高糖高脂促进凋亡，则进一步信号转导途径的改变以明确凋亡的机制1。本实验探讨葛根素对血管内皮细胞的影响,研究葛根素在AS 发生发展中的多靶点调控作用2-3。首先通过终末糖基化产物(AGE)和氧化低密度脂蛋

3、白（ox-LDL）干预离体培养胎儿脐静脉内皮细胞，从内皮细胞凋亡剥脱入手，离体探讨糖尿病与斑块糜烂的相关性，明晰斑块糜烂的发病机制；其次选择有效保护内皮细胞的中药葛根素作为研究对象，观察其稳定斑块的作用及相应机制，为合并高糖的动脉粥样硬化患者防治提供实验依据，开拓稳定斑块的新思路。1 材料与方法1.1 主要材料与仪器葛根素由协和医科大学药物研究所提供，终末糖基化产物AGES 购自博奥森试剂公司，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）购自北京中医研究院，DMEM 购自GIBCO 公司,胎牛血清购自Hyclone 公司,人脐静脉内皮细胞株ECV-304 购于天津血液病研究所。caspase3 试剂盒购自

4、Santa Cruz 公司，CD31 单克隆抗体(1100Sigma)购置天津市联星生物制剂有限；流式细胞分析仪(BD)，病理图像分析系统。1.2 细胞培养采用人脐静脉内皮细胞分离培养方法。无菌条件下取健康产妇脐带,用Hanks 缓冲液反复冲洗后,加入1%胶原酶,37消化15 min 后终止,离心后加入完全培养液DMEM(5%小牛血清,1×105U/L青霉素,1×105U/L链霉素),置于37、5%CO2 孵箱中培养,24h 后换液,待细胞80%融合,用胰蛋白酶-EDTA 消化传代,经CD31 鉴定后,第2-3 代用于实验。1.3 高糖高脂干预剂量及药物浓度的确定项目来源：

5、高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。项目编号：200600630071.3.1 高糖浓度确定用不同浓度（12.5，25，50，100，200 ug/mol）AGE 与内皮细胞共同孵育24 小时，MTT法测存活细胞数，绘制抑制率曲线 ，以确定最佳浓度，最终确定50ug/mol 为最佳浓度1.3.2 高脂浓度确定用不同浓度(0、25、50、100、200 mg/L)的ox-LDL 与内皮细胞共同孵育24 小时，MTT法测存活细胞数，绘制抑制率曲线，确定最佳浓度，最终确定50mg/L 为最佳浓度1.3.3 药物浓度设定根据前期的实验结果，葛根素与内皮细胞孵育2h 后加入高糖高脂，共同孵育24 小

6、时。MTT 法测存活细胞数，绘制抑制率曲线，确定最佳浓度,葛根素的最佳浓度是100g/m,洛伐他汀药浓度为2mg/ml,有效浓度为50umol/l。1.4 实验分组正常组：正常培养基培养细胞，不作任何处理。高糖加高脂（AGE+ox-LDL 组）：正常培养基培养细胞，并用高糖高脂进行干预。阳性对照药组（AGE+ox-LDL 组+洛伐他汀组）：在基础上，用洛伐他汀干预。AGE+ox-LDL+葛根素组：在基础上，用葛根素进行干预。1.5 方法：1.5.1 采用相应的活性Caspase3 抗体免疫细胞化学法检测。生长良好的EVC304 经消化后，接种于放有盖玻片的6 孔培养板，培养过夜，待细胞长致八成

7、满。在处理因素作用48 h 后，取出附有内皮细胞的盖玻片，PBS 冲洗3 遍，0.4g/L多聚甲醛固定，按SABC 免疫酶标试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）方法进行。每张片子按照从上倒下，从左到有顺序选取8 个视野，计数Caspase3 阳性细胞数，求得平均值作为该张片子的平均阳性细胞数。1.5.2 流式细胞仪定量检测凋亡细胞率实验用六孔培养板,1×106/孔,收集各组细胞加入罗丹明123 染液5g/mL，37，5%CO2细胞培养箱孵育10min，离心以培养基洗细胞两次，重悬细胞于培养基中，37，5%CO2培养60min ，流式细胞仪检测：激发波长488505nm，发射波长515

8、575nm（一般为530nm）；MedFitLT3.0 软件分析细胞凋亡百分率。1.6 统计学处理采用SPSS13.0 统计软件。结果用均数±标准差（ x ± s ）表示，经检验数据成正态分布，则采用单因素方差分析，以P0.05 为有统计学差异。2.结果2.1CD31 鉴定内皮细胞。培养的血管内皮细胞CD31FITC 标记的免疫荧光，在荧光显微镜下观察：胞浆染色显示绿色，中间的核不着色，证实为内皮细胞。（见图1）图1 内皮细胞FITC 标记CD31 2002.2 免疫细胞化学法检测Caspase3 凋亡细胞数葛根素处理人脐静脉EVC304 48h，caspase3 阳性细胞

9、数与对照组明显降低，内皮细胞中呈现棕褐色颗粒者为阳性细胞。（见表1）表1 各组细胞caspase3 阳性细胞数（个）（ x ± s ）分组 n caspase3 阳性细胞数正常组 8 3.375 ±1.59AGES+OX-LDL 8 22.375±9.22aAGES+OX-LDL+洛 8 15.625±4.89bAGES+OX-LDL+葛 8 15.375±4.47注：与正常组比较，a 为P<0.01;与AGES +OX-LDL 组比，b 为P<0.05,AGES+OX-LDL+洛组与AGES+OX-LDL+葛组相比，没有统计学差异

10、P>0.05。2.3 流式细胞仪检测各组凋亡百分比与正常组相比,高糖高脂培36h 后明显增加内皮细胞凋亡率,而葛根素预处理12h 后加入高糖作用36h,凋亡率明显下降。（见表2）表2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡百分率% （ x ± s ）分组 n 凋亡率正常组 8 4.46±0.44AGES+OX-LDL 8 6.10±0.36aAGES+OX-LDL+洛 8 2.40±0.12AGES+OX-LDL+葛 8 1.10±0.55c注：与正常组比较，a 为P<0.01;与AGES +OX-LDL 组比，b 为P<0.01, c

11、为P<0.05,与AGES+OX-LDL+洛组比。3 讨论血糖升高是糖尿病大血管并发症的危险因素4，高糖可以导致多种形式的血管内皮细胞功能失调，其中内皮细胞凋亡被认为与糖尿病相关的动脉粥样硬化加重有关5。本实验证明在高糖环境下葛根素具有抗内皮细胞凋亡的作用，并减弱高糖诱导的凋亡相关蛋白caspase-3活性。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程。近年人们发现了一类在细胞凋亡的信息传递中具有重要作用的蛋白酶家族caspase，目前已发现该家族中有16 个成员，caspase3 则是这一家族的重要成员，它处于细胞凋亡过程中的关键地位6。Caspase3 被

12、激活后可裂解产生相对分子质量1.7 万的活性亚单位，后者可进一步激活Caspases 活化的核酸内切酶(CAD)，活化的CAD 可切割DNA,导致细胞发生凋亡,在多种细胞的凋亡过程中均有Caspase3 的活性的变化7-8。本实验通过免疫组化的方法，检测凋亡细胞数，结果显示,在凋亡率最高的模型组中，Caspase3 阳性细胞数最高，正常组Caspase3 最低，说明Caspase3 能够直接反映细胞凋亡情况，跟凋亡密切相关。经过用药干预，各治疗组Caspase3 阳性细胞数均明显下降，细胞凋亡趋势减弱，葛根素与阳性对照组Caspase3 阳性细胞数比较，没有统计学差异P>0.05。说明葛

13、根素可通过抑制Caspase3 的表达，减少内皮细胞的凋亡。本实验采用流式细胞仪分析检测凋亡百分比。结果发现：高糖高脂可以诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡，而且进一步证明葛根素预处理后可以抑制高糖高脂诱导的内皮细胞凋亡,葛根素组和洛伐他汀作为阳性对照组内皮细胞凋亡均有明显低于模型组（P0.05），且葛根素组效果更好，说明葛根素能够抑制高糖高脂环境下的内皮细胞凋亡。最近研究表明葛根素由于其主要成分异黄酮具有雌激素样作用，因此又被归为植物雌激素。植物雌激素可以结合于雌激素受体发挥雌激素样作用，可以预防某些癌症的发生、抗氧化、清除氧自由基、降低血清胆固醇、促进细胞增殖。其对抗缺血缺氧、氧自由基过多性内皮

14、细胞凋亡的作用，有利于维持血管内皮细胞的屏障功能和内分泌功能，可以减轻缺血后炎症反应3，对预防临床溶栓或血管介入治疗中常出现的缺血/再灌注损伤具有积极意义。本研究表明，葛根素对内皮细胞有保护作用，为临床治疗提供了理论依据。参考文献1 Durand E, Scoazec A, A Lafont J, etc. Thrombotic In Vivo Induction of Endothelial Apoptosis Leads toVessel Thrombosis and Endothelial Denudation: A Clue to the Understanding of the Mechanisms ofThrombotic Plaque Erosion. Circulation 2004; 109: 2503-25062 范英昌,李妍,赵福梅.葛根素对同型半胱氨酸损伤内皮细胞的影响. 中国老年病学杂志, 2006,3（26）:372-3733 王永霞,何立人.葛根素的心血管系统药理作用及机理研究J.上海中医药杂志, 2004; 4(27):62-44 卢雪玲,谢自敬,王宁,等.2 型糖尿病患者动脉粥样硬化若干危险因素分析J.中国动脉硬化杂志,200