核苷酸代谢讲义

1、第十章 核酸代谢要求掌握：遗传信息传递的中心法则，原核细胞DNA复制及RNA转录的酶、有关概念和基本过程。熟悉：DNA半保留复制的实验证据；逆转录酶活性和逆转录的应用。了解：核苷酸分解代谢的终产物、生物合成的方式。原核生物与真核生物复制、转录的区别。重点内容：遗传信息传递的中心法则，原核细胞DNA半保留复制，RNA转录。难点内容：DNA复制的过程，原核生物RNA转录的相关概念。第一节 核苷酸的代谢一、嘌呤核苷酸的合成代谢体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径。第一，由简单的化合物合成嘌呤环的途径，称从头合成（de novo synthesis）途径。第二，利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单的反应过

2、程，合成嘌呤核苷酸，称为补救合成（或重新利用）（salvage pathway）途径。肝细胞及多数细胞以从头合成为主，而脑组织和骨髓则以补救合成为主。（一）嘌呤核苷酸的从头合成(1) 原料核素示踪实验证明嘌呤环是由一些简单化合物合成的，如图10-1所示，甘氨酸提供C-4、C-5及N-7；谷氨酰胺提供N-3、N-9; N10-甲酰四氢叶酸提供C-2, N5，N10-甲炔四氢叶酸提供C-8;CO2提供C-6。磷酸戊糖则来自糖的磷酸戊糖旁路，当活化为5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）后, 可以接受碱基成为核苷酸。其活化的反应式如下。（2）过程 合成的主要特点是在磷酸核糖的基础上把一些简单的原料逐步

3、接上去而成嘌呤环。而且首先合成的是次黄嘌呤核苷酸(IMP)，由后者再转变为腺嘌呤核苷酸(AMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)1. IMP的合成2.AMP和GMP的合成需要说明的是，AMP和GMP是不能直接转换的，但AMP可在腺苷酸脱氨酶催化下脱去氨基，生成IMP，然后再利用IMP合成GMP。 作为核酸合成的底物是核苷三磷酸的形式，通过激酶的作用及ATP供能，AMP和GMP可转变成ATP及GTP。（二）嘌呤核苷酸的补救合成虽然从头合成途径是嘌呤核苷酸的主要合成途径，但嘌呤核苷酸从头合成酶系在哺乳动物的某些组织(脑、骨髓)中不存在，细胞只能直接利用细胞内或饮食中核酸分解代谢产生的嘌呤碱或嘌呤核苷重新合

4、成嘌呤核苷酸，称为补救合成。补救合成的过程比从头合成简单得多，消耗ATP少，且可节省一些氨基酸的消耗。有两种酶参与补救合成，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyl transferase,APRT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)。补救合成同样由PRPP提供磷酸核糖。腺嘌呤核苷通过腺苷激酶（adenosine kinase）的作用可变成AMP而重新利用。类似地，其他核苷也可由相应的激酶磷酸化得到相应的核苷酸由于基因缺陷导致HGPRT活性严重不足或完全缺乏，是一

5、种X染色体连锁的隐性遗传病，称为Lesch-Nyhan综合征或称自毁容貌征，患儿在二三岁时即开始出现症状，如尿酸过量生成，智力迟钝，甚至自身毁容，这种患儿很少活到成年。现在科学家正研究将由功能的HGPRT基因，借助基因工程的方法转移至患者的细胞中，以达到基因治疗的目的。（三）嘌呤核苷酸合成的调节嘌呤核苷酸的合成受反馈抑制（feedback inhibition）调节。抑制物及作用部位1.PRPP合成酶：PRPP浓度是从头合成过程的最主要决定因素。PRPP合成的速度又依赖磷酸戊糖的存在和PRPP合成酶的活性。PRPP合成酶受嘌呤核苷酸的别构调节。其中，IMP、AMP和GMP可对PRPP合成酶反馈

6、抑制以调节PRPP的水平。2. 谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶：IMP对催化嘌呤核苷酸合成的定向步骤的酶即谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶有反馈抑制，而AMP和GMP对IMP的反馈抑制有协同作用；PRPP增加可促进谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶活性，加速PRA生成。3.过量AMP会抑制IMP转变成AMP，而过量GMP会抑制IMP转变成GMP，从而使这两种核苷酸合成速度保持平衡。另外，GTP是AMP合成时必需的能源，而ATP是GMP合成时必需的能源，这种作用使腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸的合成的以保持平衡。3嘌呤核苷酸合成的抗代谢物6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6MP)，其化学结构与次黄嘌呤相

7、似，只是后者C-6的羟基被巯基取代。它在体内可变成6-MP核苷酸，可以反馈抑制PRPP合成酶和谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶的活性，也能抑制IMP转变成AMP和GMP，从而可抑制肿瘤生长。二、 嘧啶核苷酸的合成代谢与嘌呤核苷酸一样，体内嘧啶核苷酸的合成亦有两条途径，即从头合成及补救合成。（一）嘧啶核苷酸的从头合成1、原料核素示踪实验证明，合成嘧啶碱的原料如图10-5。2、过程与嘌呤核苷酸的从头合成不同，嘧啶核苷酸是先合成嘧啶环，然后再与磷酸核糖相连，形成嘧啶核苷酸。全过程见教材，此过程主要在肝细胞的胞液中进行。除了二氢乳清酸脱氢酶位于线粒体内膜上外，其余均位于胞液中。（二）嘧啶核苷酸的补救合成由嘧

8、啶磷酸核糖转移酶(pyrimidine phosphoribosyl transferase)催化尿嘧啶、胸腺嘧啶等，与PRPP合成一磷酸尿嘧啶核苷酸（但不能利用胞嘧啶为底物）。另外，嘧啶核苷激酶可使相应嘧啶核苷磷酸化成核苷酸。（三）嘧啶核苷酸合成的调节原核生物和真核生物中，从头合成途径所需的酶不同，因而途径所受的调控也不一样。第一个调节部位在原核生物中，是天冬氨酸氨基甲酰转移酶（asparate carbamoyl transferase, ACTase），CTP是其别构抑制剂，ATP是别构激活剂。氨甲酰基磷酸合成酶在真核生物及原核生物都是反馈抑制的调控点，受UTP的抑制，但可被PRPP激活

9、。第二个调节部位是乳清酸脱羧酶处，受UMP抑制。由于PRPP合成酶是嘧啶与嘌呤两类核苷酸合成过程中共同需要的酶，它可同时接受嘧啶核苷酸及嘌呤核苷酸的反馈抑制。三、脱氧核糖核苷的生成脱氧核苷酸是由二磷酸核苷还原而成。现知脱氧核苷酸中的脱氧核糖并非先形成后再合成为脱氧核苷酸，而是在二磷酸核苷(NDP，N代表A、G、U、C、T等碱基)水平上直接还原，即以氢取代其核糖分子中C-2的羟基而成的，催化此反应的酶是核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RR)RR是一种别构酶，由B1和B2两个亚基组成，在B1亚基上有两个结合部位，一为底物特异性部位，另一为总活性调节部位。此外，B

10、1还含有巯基（SH），供直接还原核糖之用。现知RR从NADPH获得电子时，还需要一种硫氧化还原蛋白(thioredoxin,T)作为电子载体及硫氧化还原酶（thioredoxin reductase,TR）及其辅基FAD参加。整个过程如图10-8所示。RR的活性受一些别构调节剂的调节。dATP是所有四种底物还原酶的抑制剂，当dATP结合至总活性部位时，该酶活性降低，反映脱氧核苷酸过剩，ATP能消除此反馈抑制。当dATP或ATP结合至底物特异性部位时，促进嘧啶核苷酸UDP及CDP的还原。dTTP则促进GDP的还原，及抑制UDP和CDP的进一步还原。dGTP促进ADP的还原。由此可见RR有多种构象

11、状态，各具有不同的催化活性，从而为DNA合成提供数量平衡的四种脱氧核苷酸为底物。若产物不平衡会影响DNA的合成，严重者可导致疾病（见下）。四、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成首先，dUDP转换为dUMP，有几条途径，一条是在核苷单磷酸激酶催化下，dUDP与ADP反应生成dUMP和ATP；另一条途径是dUDP先形成dUTP，然后水解生成dUMP和PPi。dCMP经脱氨也可以形成dUMP。然后，dTMP是由dUMP的C-5甲基化而形成的。催化此反应的酶是胸腺嘧啶核苷酸合酶(thymidylate synthase)。甲基由N5,N10_甲炔FH4提供。反应中形成的FH2须经二氢叶酸还原酶的作用变成FH4，

12、才能重新载带甲基。 DNA合成的底物为四种dNTP，一磷酸或二磷酸脱氧核苷可由激酶的催化和ATP供能而形成三磷酸脱氧核苷。五、 核苷酸的分解代谢（一）嘌呤核苷酸的分解代谢AMP在腺苷酸脱氨酶作用下生成IMP，再在核苷酸酶作用下水解成次黄苷和磷酸，或者AMP在核苷酸酶作用下水解成腺苷，再经腺苷脱氨酶作用生成次黄苷。次黄苷经嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase, PNP）生成次黄嘌呤和磷酸核糖。磷酸核糖可转变成磷酸核糖，进入磷酸戊糖途径或再合成PRPP。次黄嘌呤既可进入补救途径，也可进一步分解，即次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化下氧化成黄嘌呤，在同一酶的催化

13、下进一步氧化成终产物尿酸。而GMP分解生成的鸟嘌呤氧化成黄嘌呤，再变成尿酸。腺苷脱氨酶（adenosine deaminase,ADA）基因缺陷是一种常染色体隐性遗传病，由于基因突变造成酶活性下降或消失，常导致AMP，dAMP和dATP蓄积，dATP是核糖核苷酸还原酶的别构抑制剂，能减少dGDP, dCDP和dTTP合成，从而DNA合成受阻。由于正常情况下淋巴细胞中腺苷酸脱氨酶活性较高，当ADA基因缺陷时，可造成严重损害，导致细胞免疫和体液免疫反应均下降，甚至死亡，即严重联合免疫缺陷症（severe combined immunodeficiency, SCID）。ADA基因突变引起的SCID

14、是第一个进行基因治疗的病种，即在体外将正常的ADA基因转导患者的淋巴细胞，再回输体内。PNP基因缺陷是一种罕见的常染色体隐性遗传病，纯合子PNP基因缺陷的患儿表现为T细胞免疫缺陷。原因是PNP不能发挥正常作用，所以患儿体内鸟苷、脱氧鸟苷、次黄苷及脱氧次黄苷浓度均增加，脱氧鸟苷转化成dGTP，造成dGTP堆积，是核糖核苷酸还原酶的别构抑制剂，导致dCDP及dCTP下降，最终DNA合成不足，影响胸腺细胞增殖，导致T细胞免疫缺陷。 可见嘌呤核苷酸的分解代谢的终产物为尿酸，后者经肾脏排泄。痛风症（gout）患者由于血中尿酸含量升高，尿酸水溶性较差，形成的晶体沉积于关节、软组织、软骨及肾等处，导致关节炎

15、、尿路结石及肾疾病等，痛风症多见于成年男性。原发性痛风症由于HGPRT活性降低，嘌呤碱不能通过补救合成途径合成核苷酸再利用，即分解成尿酸。此外，大量PRPP促使嘌呤的从头合成加快。继发性痛风症由于肾功能减退，尿酸排出减少。治疗原则：用促进尿酸排泄的药物，或用抑制尿酸形成的药物。例如别嘌呤醇（allopurinol）在体内氧化成别黄嘌呤，后者能与黄嘌呤氧化酶结合成不可逆的复合物，所以别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的强烈抑制剂。（二）啶核苷酸的分解代谢嘧啶核苷酸的分解可先脱去磷酸及核糖，余下的嘧啶碱进一步开环分解，最终产物为NH3、CO2、丙氨酸及氨基异丁酸，这些产物均易溶于水，可随尿排出体外。第二节 D

16、NA的生物合成的几个原则遗传信息传递的中心法则：一、半保留复制Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication)。用15N标记亲代的DNA链，而用14N标记新合成的DNA链的实验，证实子代的DNA分子，一股链含15N，另一股含14N。二、半不连续复制DNA双螺旋的两

17、股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为53，另一股为35。那么体内是否存在两种DNA聚合酶?一种催化核苷酸以53方向聚合，另一种以35方向聚合。但从现知所有的DNA聚合酶都只能催化53方向合成。这个问题直到1968年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌DNA复 制过程中出现一些含1000 2000个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代DNA分子中那股35方向的母链作为模板，指导新链以53方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长100

18、0 2000个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿53合成1 000 2 000个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制(semi-discontinuous replication)，如图12-2所示。复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成完整的新链。三、RNA引物目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制

19、RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5端都有一小段412个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即

20、使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶切除，便可提高DNA复制的真实性。四、复制的真实性DNA复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证DNA复制的速度，又保证产物的高度真实性。这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。第三节 参与DNA复制的一些酶类和蛋白质一、 大肠杆菌的DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase）的作用是将脱氧核苷酸连接成DNA，所用底物必须是四种脱氧核苷三磷酸(dNTP ) ，Mg2+存在和一个DNA模板，按模板的序列将配对的脱氧核苷酸逐个接上去，并且需要一个具有3-OH的RNA引物或DNA的3-OH端。使3-OH与合成上去的dNT

21、P分子-磷酸连接成3，5磷酸二酯键，合成方向为53，如图12-4。从大肠杆菌纯化得到3种DNA聚合酶(， )。(一) DNA聚合酶1955年Kornberg发现了DNA聚合酶(简称为pol)，故也称为Kornberg酶，并因此而获得诺贝尔奖金。DNA聚合酶是一条分子质量为103X103 Da的多肽链。具有多种催化功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量68X103 Da的大片段和一个分子质量为36X103 Da的小片段，常将大片段称为Klenow片段，此片段具有两种催化活性，一为上述的聚合功能，另一为35外切酶的活性，从3端水解DNA产生3单核苷酸，如图12-5所示。这种35外切酶活性对保证D

22、NA复制的真实性具有重要的意义。DNA聚合酶在接上新的核苷酸前，它能对3末端的碱基进行识别。若为配错的碱基，即通过35外切酶活性把配错的碱基切除，再使正确的碱基聚合上去，保证DNA复制的高度真实性，这种功能也称校读功能(proof reading)。小片段则具53外切酶的活性，它能从53方向一个挨一个切除，产物为5单核苷酸，或跨过若干个核苷酸再进行酶解，从5末端释放一寡核苷酸。可除去冈崎片段5端的RNA引物和在DNA损伤修复中起重要的作用。可见，DNA聚合酶为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶(图12-7)。但DNA聚合酶并不是大肠杆菌DNA复制中主要的DNA合成酶，它的主要作用，

23、是切除RNA引物、填补空缺和DNA损伤的修复。DNA聚合酶为一条多肽链上具有三种酶的活性，是一种多功能酶(图12-7)。鉴于Klenow片段兼具聚合及35外切活性，能非常准确按模板碱基序列合成DNA，所以此片段是分子生物学常用的工具酶。 (二) DNA聚合酶 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有35外切酶活性。它在生物体内的确切作用不详，可能也是在DNA损伤修复中起作用。(三) DNA聚合酶 此酶是一个多聚酶，由10种不同亚基组成的( 图12- 8)，称为DNA聚合酶全酶(DNA po1ymerase ho1oenzyme)。它具有三个特点：是一种非常高的续进性(processi

24、vity)酶。所谓续进性即在DNA聚合酶与模板分离下来之前加入的核苷酸平均数。续进性500 000。而DNA聚合酶仅合成3200个核苷酸即自模板上释放。DNA聚合酶催化活性比DNA聚合酶高很多倍，每秒可催化1 000个核苷酸的聚合，而DNA聚合酶每秒仅催化1620个核苷酸聚合。DNA聚合酶不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有35外切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌DNA聚合酶是DNA复制必需的酶。DNA聚合酶聚合和校正功能分别存在于和亚基。DNA聚合酶全酶分子质量约900X103 Da，全酶成不对称的二聚体，围绕着DNA双螺旋，每个单体都具有催化活性，一个作用于前导链，另一个作用于随从

25、链，使DNA两股链在同一位置同一时间进行合成。二、真核细胞的DNA聚合酶真核细胞的DNA聚合酶有5种，即DNA聚合酶、和。DNA聚合酶负责随从链的合成，DNA聚合酶和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)负责前导链的合成。PCNA是作为DNA聚合酶活性所需的一种辅助蛋白，有与E.coli DNA聚合酶的亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强DNA聚合酶的续进性。DNA聚合酶负责线粒体DNA(mitochondria DNA, mt DNA)的复制，DNA聚合酶和的功能为DNA的修复。三、解旋、解链酶类复制时DNA双螺旋要解开，

26、才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要不断解开。若每秒钟复制1 000个碱基对，则要解旋100次。这样必然在复制前方产生很大的张力，使DNA缠结，这要靠DNA拓扑异构酶等来解决。(一) DNA解链酶DNA复制时，复制开始部位的DNA双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱基配对原则，指导新链的合成。解开DNA双螺旋的酶有多种，称为DNA解链酶(DNA helicase)，该酶具有ATP酶的活性，在ATP的存在下，该酶能解开DNA双链，每解开1对碱基消耗2个ATP。(二) 单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白(single strand binding protein，SSB)或

27、螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein HDP)，能与已被解链酶解开的单链DNA结合，以维持模板处于单链状态，又可保护其不被核酸酶水解。单链DNA结合SSB后既可避免重新形成双链的倾向，又可避免自身发夹螺旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当DNA聚合酶在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时，SSB即不断脱离，又不断与新解开的链结合。(三) DNA拓扑异构酶拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA拓扑异构酶(topoiso-merase)有两类：其中拓扑异构酶，曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断DNA双链中的一股，使DNA解

28、链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭。拓扑异构酶，又称旋转酶(gyrase)，暂时切断DNA双链，使另一DNA双链经过此切口，随后又再封闭切口。四、引发体引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位，DnaB具有解链酶的作用，DnaC辅助DnaB结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合，合成一小片段的RNA，作为DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3-OH进行延伸。五、DNA连接酶DNA连接酶(DNA 1iga

29、se)催化两段DNA链之间磷酸二酯键的形成。要求DNA链3端有游离的OH，而5端带有磷酸根，连接过程需要ATP供能,如图12-9。DNA连接酶不能连接两分子单链的DNA，只能作用双链DNA分子中一股链上的缺口，或双链DNA分子双股的缺口。如DNA经限制性内切核酸酶切割后，两个片段的粘性末端相配，DNA连接酶能使之连接。即使是两段平齐DNA，DNA连接酶也能使之连接。在DNA复制过程中，当RNA引物清除后，靠DNA聚合酶填补空缺，冈崎片段之间的缺口靠DNA连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA连接酶在DNA损伤修复中亦起重要作用，并且是一种重要的工具酶。第四节 DNA复制过程一、复制的起始大肠杆

30、菌复制时有特定的起始部位称为oriC，长度为245bp。有3个串连排列的核苷酸序列，每个由13个核苷酸组成。其序列基本相同为GATCTNTTNTTTT，而且GATC在oriC部位出现11次，oriC还有4个DnaA结合位点，是4个 9bp序列的反向重复，这些序列都是高度保守的（图12-10。）DnaA先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB和DnaC亦参加进去，从而使双链解开，DNA结合蛋白便与单链DNA结合。接着引物酶按碱基配对原则合成一小段的RNA引物，此引物的3-OH可供DNA聚合酶将第一个dNTP加到3-OH上而形成3，5磷酸二酯键。复制是从oriC开始，同时向两个方向进行的

31、，称为双向复制(bi-directional replication)。 复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察DNA复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉(replication fork)，如图12-12。二、 复制的延长在DNA聚合酶的作用下，新合成的DNA链不断延长。大肠杆菌的冈崎片段长度为1 0002 000个核苷酸，即前导链合成1 0002 000个核苷酸后，随从链便开始合成。在延长过程中，由于拓扑异构酶的作用，避免了在复制叉前方的DNA打结。三、复制的终止在DNA延长阶段结束后，原核生物的RNA引物被DNA聚合酶切除。留下的空隙，由DNA聚合酶进行补满

32、，即从另一冈崎片段的3-OH按53根据碱基配对原则，将一个个的dNTP补上去。最后的缺口再由DNA连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键连起来，即成完整的一条新链，DNA的复制即告完成，如图12-15。四、真核生物端粒DNA的复制真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述DNA复制机制新合成子链5端的那段RNA引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或DNA复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。端粒DNA的结构和端粒酶对端粒DNA序列的分析，发现端粒DNA的3端是由数百个串

33、联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5-CAACCCCAA-3可作为合成端粒DNA3端GT 丰富序列-GGGGTT-

34、模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这样可防止细胞分裂时DNA复制端粒的缩短。 端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。五、原核细胞和真核细胞DNA复制的区别-见P501六、 逆转录合成DNA 某些病毒的基因组是RNA，而不是DNA，这类病毒称为RNA病毒。1964年Temin观察到有些致肿瘤的RNA病毒（如鸡肉瘤病毒avian sarcoma virus，ASV）感染细胞的作用能被DNA复制抑制剂（

35、如甲氨喋呤，MTX）、5FdUMP等所阻断，说明ASV的繁殖需要DNA的合成。另一发现为放线菌素D能抑制子代病毒颗粒的产生。放线菌素D是抑制以DNA为模板的RNA合成，这说明RNA肿瘤病毒在宿主细胞的繁殖，需要通过细胞RNA的合成。因此，Temin大胆提出一种设想，即RNA肿瘤病毒先变成DNA原病毒(provirus)，再产生RNA肿瘤病毒。这意味着遗传信息也可以从RNA流向DNA。1970年Temin和Baltimore各自发现RNA肿瘤病毒含有一种酶，称为逆转录酶(reverse transcriptase)。这种酶以RNA为模板，在有4种dNTP存在及合适条件下，能按碱基互补配对的原则，

36、合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。这种酶也称RNA依赖的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。由于RNA肿瘤病毒含有这种逆转录酶，所以也称为逆转录病毒(retrovirus)。这一发现使生物中心法则内容更充实和完善。Temin和Baltimore也因此而获得诺贝尔奖金。1、逆转录：以RNA为模板，dNTP为原料，按碱基配对规律合成DNA的过程，由逆转录酶催化。2、逆转录酶（reverse transcriptase）又称为反转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)逆转录酶是多

37、功能酶，有三种酶活性：逆转录活性：即以RNA为模板合成DNARNaseH活性：水解RNA:DNA中的RNADNA pol活性：以DNA为模板合成DNA3、生物学意义（1）（2）（1） 丰富和发展了中心法则（2） 丰富和发展了致癌理论（3） 在基因工程中的应用第五节 RNA合成（转录）转录 (transcription) 是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。 表1 转录与复制的异同差 异 相 同转录 复制 或相似模板 基因的模板链转录 2股链均全复制 DNA原料 NTP dNTP 核苷三磷酸碱基配对 A-U，T-A；G-C A-T；G-C 遵从

38、碱基配对原则聚合酶 RNA聚合酶 DNA聚合酶 依赖DNA的聚合酶 产物 mRNA，tRNA，rRNA等 DNA 多核苷酸链转录的模板是单链DNA，与复制的模板有较多的不同特点，引出了下列相关概念。转录过程只以基因组DNA中编码RNA（mRNA、tRNA、rRNA及小RNA）的区段为模板。把DNA分子中能转录出RNA的区段，称为结构基因（structure gene）。结构基因的双链中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称为模板链(template strand)，也称作Watson（W）链(Watson strand)、负（-）链(minus strand)或反意义链(antisense st

39、rand)。与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列与mRNA的密码序列相同（仅T、U互换），称为编码链(coding strand)，也称作Crick（C）链（Crick strand）、正（+）链(plus strand)，或有意义链(sense strand)。不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并不是固定在某一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetric transcription)。模板链在相同双链的不同单股时，由于转录方向都从53，表观上转录方向相反。与DNA复制类似，转录过程在原核生物和真核生物中所需的酶和相关因子有所不同，转录过程及转录后的加工修饰亦有差异。一、参

40、与 转 录 的 酶转录酶（transcriptase）是依赖DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP），亦称为DNA指导的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase），简称为RNA聚合酶（RNA pol）。它以DNA为模板催化RNA的合成。原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转录起始部位，催化2个游离的NTP形成磷酸二酯键而引发转录的起始，如图13-2所示。因此，转录的起始不需引物，这也是转录与复制在起始阶段的一大区别。（一） 原核生物的RNA聚合酶细菌中只发现一种RNA聚合酶，能催化mRNA，tRNA和rRNA等

41、的合成，研究得比较清楚的是大肠杆菌（E coli）的RNA聚合酶。1、 大肠杆菌RNA聚合酶的组成大肠杆菌RNA聚合酶的分子量约450kDa，由四种5个亚基（2）组成全酶（holoenzyne），亚基与全酶疏松结合，在胞内、外均容易从全酶中解离，解离后的部分（2）称为核心酶（core enzyme）。通过利福霉素等抑制转录的实验研究，对转录酶各亚基的功能已有一定的认识：亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动子，从而决定哪些基因可转录；亚基与底物（NTP）及新生RNA链结合；亚基与模板DNA结合；和亚基组成酶的活性中心，通过DNA的磷酸基团与核心酶的碱性基团间的非特异性吸附作用，核心酶能与模板DN

42、A非特异性松驰结合；亚基的功能是识别启动子，辩认转录起始点，但不能单独与DNA模板结合，当它与核心酶结合时，可引起酶构象的改变，从而改变核心酶与DNA结合的性质，使全酶对转录起始点的亲和力比其他部位高4个数量级，在转录延长阶段，亚基与核心酶分离，仅由核心酶参与延长过程。因此，亚基实际上被认为是一种转录辅助因子，因而称为因子(factor)。2、因子生物体在生命周期的不同阶段或在内、外环境有所变化时，其基因表达有一定的时、空顺序，以适应生长、发育及环境变化的需要。RNA聚合酶的活性是决定基因表达的重要一环。而因子是RNA聚合酶识别及结合启动子的亚基，原核生物中所有RNA的转录都由同一种RNA聚合

43、酶催化，在生命周期的不同阶段或不同环境下，这个酶如何识别所有转录单位的启动子，是由识别启动子的因子来完成的。基因启动子 -35和-10区的共有序列（图13-3）是因子识别的位点，如表13-2所示，不同的因子能识别的共有序列可以完全不同。（二） 真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶已发现有三种，称为RNA聚合酶I、II和III，分别负责转录不同的RNA，它们对特异性抑制剂鹅膏蕈碱的敏感性亦有差异，如表13-3所示。二、 转录过程转录是生物合成RNA的过程，与复制相似，有起始、核苷酸链延长和链合成终止三个阶段。（一） 转录的起始 转录的起始，就是形成转录起始复合物的过程。这一阶段反应所需的

44、辅助因子，在原核生物与真核生物之间有较大的差异。 1、 原核生物转录的起始转录的起始由RNA聚合酶与DNA模板的启动子(promoter)结合。经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析，发现启动子具有下列的共同点：在-10bp处有一段共有序列（consensus sequence），富含AT，即 TATAAT-，系Pribnow等首先发现，因而称为Pribnow盒（box），再往上游-35bp的中心处又有一组保守的共有序列，即-TTGACT-。启动子邻近的结构示如图13-3。结合过程可分为二个步骤，首先由因子辨认启动子的35区，全酶与该区结合，形成疏松的复合物，此时DNA双链未解开，因而

45、称为封闭型转录起始复合物，继而RNA聚合酶移向10区及转录起始点，在20区处DNA发生局部解链，形成1217bp的单链区，RNA聚合酶与DNA结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以单链的模板链为模板，RNA聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的NTP占据，聚合酶的亚基催化第一个磷酸二酯键的生成，亚基从全酶解离，形成DNA-RNA聚合酶（核心酶）结合在一起的起始延伸复合物。2、真核生物转录的起始真核生物有三种RNA聚合酶，分别催化不同RNA的合成，每种酶都需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子(transcription factor,TF)。为方便讨论，转录因子的命名冠以聚合酶的名称。如RNA聚

46、合酶所需的转录因子称为转录因子（transcription factor, TF）。 （二） 转录的延长转录延长阶段发生的反应，在原核生物和真核生物比较相近。总的来说，一是聚合酶如何向转录起始点下游移动，继续指导核苷酸之间磷酸二酯键的形成，二是转录区的模板如何形成局部单链区，便于转录。原核生物RNA聚合酶催化转录起始，即核苷酸链中的第一个磷酸二酯键形成后，因子从全酶中解离出来，核心酶就能沿DNA分子移动，真核生物RNA聚合酶不仅需要较多的转录因子来催化起始，而且转录起始后，酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在TFH等作用下，聚合酶C端丝氨酸残基的磷酸化是聚合酶向下游

47、移动的重要因素。在转录延长过程中，DNA双链需解开1020 bp，形成的局部单链区象一个小泡，故形象地称为转录泡（transcription bubble）。转录泡是指RNA聚合酶-DNA模板-转录产物RNA结合在一起形成的转录复合物。为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需不断解链，可使其下游的DNA（未解开双链部分）越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游DNA变得松驰，产生负超螺旋，需要解旋酶（gyrase） 和拓扑异构酶来消除这些现象，如图13-7。转录起始复合物中，核苷酸之间第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3-OH与第二个核苷酸的5-磷酸之间脱水而成。第一个核苷酸常为G

48、，来自GTP的5-三磷酸仍保留，第二个核苷酸的3-OH仍然游离形成5pppGpN-OH3。在聚合酶沿模板链的35移动时，可按模板链碱基序列的指引，相应NTP上的-磷酸可与延长新链的3-OH相继形成磷酸二酯键，其、磷酸基脱落生成焦磷酸后迅速水解，释放的能量进一步推动转录，使新合成的RNA链沿着5 3方向逐步延长。在转录局部形成的RNADNA杂化双链之间的引力比DNA双链的弱（因为杂化双链间存在dArU配对， dArU的稳定性比dAdT的小），延长中的RNA链的5-端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA的5-端游离于转录复合物。（三） 转录的终止 1、 原核生物转录的终止原核生物转录的终

49、止有两种主要机制。一种机制是需要蛋白质因子（Rho）的参与，称为依赖因子(factor)的转录终止机制，另一种机制是在离体系统中观察到，纯化的RNA聚合酶不需要其他蛋白质因子参与，可使转录终止，称为不依赖因子的转录终止机制。（1）依赖因子的转录终止： 因子是一种分子量为46kDa的蛋白质，以六聚体为活性形式。依赖因子的终止位点，未发现有特殊的DNA序列，但因子能与转录中的RNA结合。因子的六聚体被约7080 nt的RNA包绕，激活因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3端滑动，滑至RNA聚合酶附近时，RNA聚合酶暂停聚合活性，使RNADNA杂化链解链，转录的RNA释放出来而终止转录。

50、如图13-8所示。（2）不依赖因子的转录终止： 在这种转录终止系统中，模板DNA在终止位点附近有特殊的连续T序列，在连续T之前有富含GC互补区及几个插入碱基，如图13-9。这种互补区的转录物可形成茎-环结构，影响RNA聚合酶的构象使转录暂停；同时，由于转录产物的（rU）n与模板的（dA）n之间的dArU杂交区的双链是最不稳定的双链，使杂化链的稳定性下降，而转录泡模板区的两股DNA容易恢复双链，释出转录产物RNA，使转录终止。2、 真核生物转录的终止真核生物转录终止的机制，目前了解尚不多，而且3种RNA聚合酶的转录终止不完全相同。RNA聚合酶催化的转录有18 bp的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含GC的茎-环结构(stem-loop structure)和连续的U。由于成熟的mRNA 3端已被切除了一段并加入了poly A尾,具体的转录终止点目前尚未认识。三、 转录的抑制作用（一）作用于模板DNA的转录抑制剂如放线菌素D（actinomycin D），能插入至DNA双链