第四章组织培养的基本操作技术

1、第四章第四章 植物组织培养的植物组织培养的基本操作技术基本操作技术1 器皿、工具的洗涤器皿、工具的洗涤l要用洗涤剂去掉要用洗涤剂去掉油脂和有机物油脂和有机物；用；用1%1%左右的盐左右的盐酸可将酸可将可溶性无机物可溶性无机物洗去洗去l对难洗的或太脏的器皿有时要对难洗的或太脏的器皿有时要浸泡浸泡过过夜夜l洗后洗后口向下或垂直放置口向下或垂直放置，晾干或烘干备用；带刻，晾干或烘干备用；带刻度的器皿不能烘干，急用的？度的器皿不能烘干，急用的？l污染的一次性消耗品或装有曾污染的培养基或组污染的一次性消耗品或装有曾污染的培养基或组织的器皿，要在织的器皿，要在高压灭菌高压灭菌 后后再处理。再处理。洗液的配

2、制洗液的配制l4040克工业用重铬酸钾溶于加热克工业用重铬酸钾溶于加热100100毫升水，冷毫升水，冷却后慢慢加却后慢慢加900900毫升工业用浓硫酸，边加边搅毫升工业用浓硫酸，边加边搅拌，在玻璃缸或瓷缸中加盖备用。拌，在玻璃缸或瓷缸中加盖备用。2 灭菌方法灭菌方法l培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染，培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染，微生物生长大大快于植物学组织，微生物生长大大快于植物学组织，大量消耗营大量消耗营养养污染微生物还可能大量污染微生物还可能大量分泌和排泄一些对植物分泌和排泄一些对植物学有毒害的物质学有毒害的物质，使培养的植物组织难以生活，使培养的植物组织难以生活下去

3、下去为防止污染，应注意；为防止污染，应注意；l不与微生物或病理工不与微生物或病理工作者共用组织培养工作者共用组织培养工作区作区l一但发现污染，立即一但发现污染，立即将污染的培养物拿出将污染的培养物拿出培养室进行灭菌处理培养室进行灭菌处理有菌的概念有菌的概念l凡是暴露在空气中未经处理的物体，曾经接触凡是暴露在空气中未经处理的物体，曾经接触过自然水源的物体表面，都是有菌的过自然水源的物体表面，都是有菌的l菌的特点是无处不在，无孔不入，在自然而然菌的特点是无处不在，无孔不入，在自然而然条件下忍耐力强。生活条件下要求简单，繁殖条件下忍耐力强。生活条件下要求简单，繁殖力强。力强。l菌：包括细菌、真菌、放

4、线菌、藻类及其它微菌：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。这些生物个体极小，肉眼看不到。生物。这些生物个体极小，肉眼看不到。无菌的概念无菌的概念l经过高温灼热或煮过足够长时间的物体，经其经过高温灼热或煮过足够长时间的物体，经其它物理或化学灭菌方法处理后的物体，有可能它物理或化学灭菌方法处理后的物体，有可能是无菌的。是无菌的。l高层大气、岩石内部、健康的植物动物内部不高层大气、岩石内部、健康的植物动物内部不与外表面接触的组织内部有可能是无菌的与外表面接触的组织内部有可能是无菌的l强酸强碱、化学灭菌剂等是无菌的强酸强碱、化学灭菌剂等是无菌的杀菌方法杀菌方法l物理方法：高温物理方法：高温 湿热

5、（湿热（121 1.1 15-20分分钟钟 ） 和干热和干热（160-180 2-3小时）小时）高压锅操作加水高压锅操作加水 放入物品放入物品 加热加热 排除冷排除冷空气空气 稳压稳压 冷却冷却 接种工具、瓶子、滤膜、针头、针管、容器等到接种工具、瓶子、滤膜、针头、针管、容器等到可用这种方法可用这种方法l射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量无菌水反复冲洗等，无菌水反复冲洗等，l化学方法：各种化学药剂化学方法：各种化学药剂 双氧水、来苏水、双氧水、来苏水、升汞、新洁尔灭等升汞、新洁尔灭等l空气的过滤灭菌空气的过滤灭菌 超净工作台的工作原理就是超净工作台的工

6、作原理就是通过不同等级的细菌过滤膜创造一个无菌的空通过不同等级的细菌过滤膜创造一个无菌的空间间l液体的过滤灭菌液体的过滤灭菌使用孔径使用孔径0.45微米或更小的滤膜微米或更小的滤膜1先对滤膜、细菌过滤器、无菌液收集容器等进先对滤膜、细菌过滤器、无菌液收集容器等进行高温高压灭菌行高温高压灭菌2在超净工作台上等培养基冷却至在超净工作台上等培养基冷却至40度左右时加度左右时加入灭菌后的过滤液，混匀放置备用。入灭菌后的过滤液，混匀放置备用。3不能在培养基温度较高时加入，防止不耐热物不能在培养基温度较高时加入，防止不耐热物质的分解质的分解l接种用具的灭菌接种用具的灭菌l接种服、帽子、口罩的灭菌接种服、帽

7、子、口罩的灭菌l塑料器皿塑料器皿 的灭菌的灭菌3 植物材料的表面灭菌植物材料的表面灭菌l接种就是将处理好的接种就是将处理好的无菌的外植体无菌的外植体经过经过无菌无菌操作操作放置在灭过菌的培养基上过程放置在灭过菌的培养基上过程l外植体的采集外植体的采集刷洗刷洗冲洗冲洗表面灭菌表面灭菌 70%的酒精的酒精 穿透菌孢子的能力最强穿透菌孢子的能力最强表面活性剂表面活性剂1%吐温吐温80或吐温或吐温20 或或Triton-X 其它灭菌剂其它灭菌剂灭菌剂对植物也是在毒的，要注意灭菌剂对植物也是在毒的，要注意浓度和时间浓度和时间表-1 常用外植体消毒剂的性质和消毒效果比较化合物 应用浓度范围 清除程度 处理

8、时间/min 备注次氯酸钠1%-1.4%*市售溶液的浓度通常为20%（体积分数）；注“+”越多表示清除程度越高。+5-30非常有效次氯酸钙9%-10%+5-30非常有效过氧化氢10%-12%+5-15有 效溴 水1%-2%+2-10非常有效硝酸银1%+5-30有效氯化汞0.01%-0.1%2-10满意抗生素4-50mg/l+30-60有效l茎尖、茎段或叶片茎尖、茎段或叶片 刷洗刷洗 2-10%次氯酸次氯酸钠泡钠泡4-15分钟分钟 无菌水冲洗无菌水冲洗2-3l果实、种子自来水冲洗果实、种子自来水冲洗10-20分分l花药花药 70%酒精几秒酒精几秒 无菌水冲洗无菌水冲洗2-3次次 10%漂白粉漂白

9、粉10分钟分钟 无菌水冲洗无菌水冲洗2-3次次 l根及地下器官根及地下器官 l难灭菌难灭菌 的用的用0.1-0.2%的升汞或者的升汞或者1-2%的的溴水溴水4无菌操作技术无菌操作技术l提前准备工作提前准备工作l操作时的注意操作时的注意外植体接种全过程：外植体接种全过程： 酒精擦拭手酒精擦拭手 外植体消毒浸泡外植体消毒浸泡 器械消器械消毒毒 酒精擦拭培养皿酒精擦拭培养皿 取外植体取外植体 修剪外植体修剪外植体 旋转灼烧瓶口旋转灼烧瓶口 接种接种 封口封口5 组织培养中常见问题解决组织培养中常见问题解决l（1）褐化）褐化l培养过程中细胞中培养过程中细胞中多酚氧化酶激活多酚氧化酶激活后，酚类被后，酚

10、类被氧化成氧化成棕褐色的醌类物质棕褐色的醌类物质，这种致死性物质会，这种致死性物质会扩散，使培养基变褐，还会抑制其它酶的活性，扩散，使培养基变褐，还会抑制其它酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐死亡。褐死亡。1.植物种类和品种植物种类和品种2.生理状态生理状态l处于处于幼龄期幼龄期的植物材料较从成年植株采集的植物材料的植物材料较从成年植株采集的植物材料褐化程度轻；老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重褐化程度轻；老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重 。l处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所以以夏季

11、夏季时取材更容易发生褐化，时取材更容易发生褐化，冬春季节冬春季节取材则材料取材则材料褐化死亡率最低褐化死亡率最低 注意取材时间和部位注意取材时间和部位 3.培养基成份培养基成份l无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加；细无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加；细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加重。活性，从而使褐化现象加重。 4.培养条件不当培养条件不当l如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。酚

12、氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。 5.其它原因其它原因l防治措施防治措施l选择适宜的外植体和培养基选择适宜的外植体和培养基 适当降低培养基的无机适当降低培养基的无机盐、降低盐、降低PH值、降低细胞分裂素水平等值、降低细胞分裂素水平等l连续转移连续转移l加抗氧化剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、加抗氧化剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（聚乙烯吡咯烷酮）l加活性炭加活性炭 0.1-0.5%l加多胺类物质，如精胺、亚精胺加多胺类物质，如精胺、亚精胺l（2）玻璃化）玻璃化l组培苗组培苗含水量过高，茎叶呈透明状含水量过高，茎叶呈透明状、叶片卷曲、叶片卷

13、曲等到畸形，不能生根移栽等到畸形，不能生根移栽玻璃化苗的症状表现玻璃化苗的症状表现l试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明；孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明；l叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎；叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎；l组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低；组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低；l试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。活率极低，因而繁殖系数低。l原因原因 l植物种类植物种类 l

14、培养基硬度和离子比例培养基硬度和离子比例 l培养基中激素培养基中激素 CTK高高l环境湿度环境湿度 l措施措施l适当控制培养基中离子浓度适当控制培养基中离子浓度l适当控制培养基中糖和琼脂适当控制培养基中糖和琼脂 的量的量l适当降低适当降低CTK和和GA的浓度的浓度l控制好湿度控制好湿度l增加自然光照，控制光照时间增加自然光照，控制光照时间l改善培养瓶的气体交换情况改善培养瓶的气体交换情况l在培养基中添加其它物质在培养基中添加其它物质l（3）污染）污染l污染源有污染源有细菌和真菌两类细菌和真菌两类l培养基污染的可能性来源：培养基污染的可能性来源： 细菌污染细菌污染（1）现象）现象在培养材料附近出

15、现粘液状物或混浊的水迹痕在培养材料附近出现粘液状物或混浊的水迹痕或出现泡沫塑料的发酵状情况或出现泡沫塑料的发酵状情况或在培养基中出现浑浊和云雾状痕迹或在培养基中出现浑浊和云雾状痕迹特点是特点是菌斑呈现粘液状物，通常菌斑呈现粘液状物，通常 在接种后在接种后1-2天天就可发现就可发现l（2 2）原因）原因材料带菌材料带菌培养基灭菌不彻底培养基灭菌不彻底工作人员的操作：如使用了未经灭菌的工具、呼工作人员的操作：如使用了未经灭菌的工具、呼吸时呼出细菌、手接触了材料或是器皿边缘使吸时呼出细菌、手接触了材料或是器皿边缘使微生物落入等微生物落入等l（3 3）防治方法）防治方法l手的清洁与灭菌手的清洁与灭菌l

16、接种操作中要接几瓶就用接种操作中要接几瓶就用70%70%酒精擦拭，工具酒精擦拭，工具要常灼烧灭菌要常灼烧灭菌l丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌后，减少污染源后，减少污染源l真菌污染真菌污染l（1 1）现象）现象l培养基上长霉，接种培养基上长霉，接种3-53-5天能发现，有白、黄、天能发现，有白、黄、黑色的黑色的l特点是污染部位长出不同颜色的霉菌，在接种特点是污染部位长出不同颜色的霉菌，在接种3 3天后，有时天后，有时1010天才能表现出颜色和症状天才能表现出颜色和症状l（2 2）原因）原因l通常通常 是周围环境不清洁或空气污染造成是周围环境不清洁或空气污染造成l接种室不清洁，灰尘太多接种室不清洁，灰尘太多l超净工作台的过滤装置失效超净工作台的过滤装置失效l培养用器皿口径太大培养用器皿口径太大l操作不慎，如打开瓶塞时使瓶口边的真菌孢子操作不慎，如打开瓶塞时使瓶口边的真菌孢子落入，解开包头纸或橡皮筋时弹起了真菌孢子，落入，解开包头纸或橡皮筋时弹起了真菌孢子，污染了空间污染了空间l（3 3）防治方法）防治方法l接种室的空气循环灭菌和紫外灭菌要严格接种室的空气循环灭菌和紫外灭菌要严格l工作台的空气过滤装置要常检查并提前开启工作台的空气过滤