微生物测定方法

1、环境环境微生物新技术导师： 汇报人： 学号：Part1写 下 大 标 题我所在课题组主要研究方向是： 景观水体富营养化治理及水体修复与净化技术故所关注的微生物主要与引起富营养化的藻类有关： 主要研究的藻类有：铜绿微囊藻、小球藻、伪鱼腥藻、水华鱼腥藻等。下面我就其中的 来做一些说明介绍。水华鱼腥藻水华鱼腥藻的图片 水华鱼腥藻 界门纲目科属种植物界Alage 蓝藻门Cyanophyta 蓝藻纲 Cyanophyceae 念珠藻目Nostocales 念珠藻科Nostocales 鱼腥藻属Anabaena 水华鱼腥藻 Anabaena aquae蓝藻门 蓝藻细胞无色素体和真正的细胞核等细胞器，繁殖方

2、式常为细胞分裂。常生长在各种水体或潮湿土壤、岩石、树干及树叶上，不少种类能在干旱的环境中生长繁殖。水生类群常在含氮较高，有机质丰富的碱水体中生长。 蓝藻能进行光合作用的自养型微生物，其大量生长可改变水体的理化环境，产生各种有害代谢产物，如毒素和异味物质，给公众健康带来极大隐患，同时蓝藻水华也给水产养殖业、供水及旅游业带来极大的危害。 鱼腥藻属 植物体为单一丝体，或不定型胶质块，或柔软膜块；藻丝等宽或末端尖、直或不规则的螺旋状弯曲；细胞球形，筒形；异形胞常为间位；孢子1个或几个成串，紧靠异形胞或位于异形胞之间。水华鱼腥藻 水华鱼腥藻在国内外发生的蓝藻水华中经常有报道。这是一种具有异形胞的丝状体蓝

3、藻，一般不能作为鱼类饵料，有固氮的功能。 在春末、夏初、初秋时，此类藻常在湖沼、池塘大量繁殖，造成“水华”，引起水质变臭，并且可产生藻毒素，对水生生物有毒害作用，破坏水生生态系统。故可作为水体发生富营养化的指标，研究其生长特征、生态生理功能及其环境效应对解决水体富营养化有重要意义！Part2写 下 大 标 题 微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大类，由于多数微生物的个体较小，肉眼无法观察 ，对其计数一般比较困难。此外，不同环境介质中的微生物种类和特点，以及所处的环境条件不同，那么所采取的微生物数量测定方法也有所差异。对微生物计数的方法主要有三大类：总细胞计数法、活细胞计数法和微生物

4、生长量测定法 。一、方法概述总细胞计数法活细胞计数法 微生物生长 量计数法（1） 平板菌落计数法（2） 比浊法（3） 霉菌计数法3.1 凯氏定氮计数法3.2 DNA含量测定法 总细胞计数法 活细胞计数法 微生物生长量计数法（1）血细胞计数板计数法 （2）细菌计数板计数法 （3） 膜过滤计数法各方法的比较总结：血细胞计数板和细菌计数板：常用于测定单细胞或孢子 ,相对比较准确；显微镜直接计数法：不辨死活；膜过滤：用于测定细胞浓度很低的样品 ,平板菌落计数：形成菌落的微生物，对多数微生物的测定都适用 ,相对复杂；比浊法：相对准确 ,但需要标准曲线，不用于颜色太深的样品；凯氏定氮法和DNA含量测定法：

5、对微生物细胞内含量相对稳定的物质进行定量测定 , 再算出细胞的数量 ,操作相对复杂。测定细胞总氮量或总碳量：适于浓度较高的样品各方法的比较总结：（一）空气中 空气中没有可为微生物直接利用的营养物质和足够的水分，它不是微生物生长繁殖的天然环境，因此空气中没有固定的微生物种类。它主要通过土壤尘埃、小水滴、人和动物体表的干燥脱落物、呼吸道的排泄物等方式被带入空气。由于微生物能产生各种休眠体，故可在空气中存活相当长的时期而不至死亡。 空气中微生物的种类，主要为真菌和细菌。其数量则取决于所处的环境和飞扬的尘埃量。 适用于空气中微生物数量测定方法主要有：1.自然沉降法（沉降平板法）2.撞击法 3.过滤法

6、4.液体撞击法 二、空气中微生物数量测定方法 ： 1.自然沉降法（沉降平板法） 根据空气中携有微生物气溶胶粒子在地心引力作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上，经24h,37温箱培养计算菌落数。 根据奥梅梁斯基建议，面积为100cm2的平板培养基，暴露于空气中5min,于37温箱培养24h后所生长的菌落数相当于10L空气中的细菌数。空气中的细菌数（cfu/m3）=1000（100/A）(5/t)(1/10)N =50000N/(AT) A-平板面积cm2；T-暴露时间min；N-平均菌落数(cfu/皿) 特点：简单方便，但稳定性差，直径15um的粒子在5min内沉降距离有限，使小粒子采集效

7、率低。 二、空气中微生物数量测定方法举例 2.撞击法 Anderson采样器原理：多级筛孔型采样器 由6个带有微细针孔的金属撞击盘构成，盘下放置有培养基的平皿，每个圆盘上有400个环形排列小孔，由上到下孔径逐渐减小。气流从顶罩进第一级，较小的粒子会由于动量不足随气流绕过平皿进入下一级。经6次撞击后，可把绝大部分的微生物采集下。 空气含菌量(cfu/m3)=【六级采样板的总菌数(cfu)28.3(L/min)采样时间(min)】1000 ：a.采集粒谱范围广，一般在0.220um以上； b.采集效率高，逃逸少； c.微生物存活率高。 二、空气中微生物数量测定方法特点 3.过滤法 使一定量的空气通

8、过吸附剂（灭菌生理盐水），然后培养吸附剂中的细菌，计算出菌落数。 4.液体撞击法 和固体撞击式采样器一样，是利用喷射气流方式将空气中的微生物粒子采集到小体积液体中，适用于高浓度的空气微生物采样。 二、空气中微生物数量测定方法 （二）水样样中： 适用于水样中微生物数量测定方法有： 三、水样中微生物数量测定方法水样中细菌 总数测定水中细菌活菌数测定分光光度计测定细菌数量1.直接计数法.染色涂片计数法3.比浊度法 1.平板菌落计数法 2.液体稀释法 3.滤膜过滤计数法应用光电比色计或分光光度计测定（标准曲线） 标准平皿法测定水中细菌总数（1）采集水样；（2）取10ml注入90ml无菌水的三角瓶中，混

9、匀成10-1稀释液，注意吸水样前，水样及稀释水应混合均匀；（3）吸取稀释液1ml按10倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4等系列的稀释度； (4)根据水样洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度，中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度。稀释度的选择是关键，选择适宜，平皿上菌落总数介于30到300间；（5）吸取由高倍到低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1ml; (6)注入彻底融化且冷却到45的营养琼脂培养基约15ml,立即旋摇培养皿，充分混匀。让平皿培养基于水平位置至固化；（7）接种河水水样的培养皿，倒置于37培养24h。接种海水水样的培养皿则

10、置于1820培养5d(长出明显菌落)； (8)根据菌落计算原则和方法计算。 三、水中微生物数量测定方法举例 （三）土壤中： 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。适于土壤微生物数量测定方法可分为三大类： 四、土壤中微生物数量测定方法将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括:a.涂片法、 b.琼脂薄片法 c.膜过滤法根据培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物数量，统称为培养计数法，主要有：a.稀释平板法、 b.最大或然计数法直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。

11、 1.稀释平板法测定土壤中微生物数量（1）土壤系列稀释液制备 ：取新鲜土壤（2）10.00g，放入装有70ml水的广口瓶中，在振荡机上振荡10min。迅速吸取10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，混合均匀。如此依次配制一系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。（2）平板制备和培养 ： 从两个稀释倍数的土壤稀释液中吸取1.00ml，分别放入五套培养皿中；再向培养皿内注入4550的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28下培养710d，真菌在25下培养35d。（3）镜检计数 ：用显微镜观察，明显有菌丝的一般是真菌，丝状分枝，比较粗大

12、；而放线菌菌丝呈放射状，较细。细菌有球状和杆状，酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状芽。 在两级稀释度中，选细菌和放线菌菌落数为30200个、真菌菌落数为2040个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成24等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。4）计算 ：土壤微生物数量（cfu/g）=MD/W 式中: M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。 四、土壤中微生物数量测定方法举例 2.FDA染色涂片法测定土壤中活菌丝数（1）土壤分散 取10.00g新鲜土壤（2）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 molL-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡1