第二章 双碟制备

1、第二章 双碟的制备 主要内容： 一、培养基的制备 二、双碟的制备方法 一、培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素 不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求有很大差异。 目前已使用的各种培养基都是前人经过反复实践，比较设计的成果。 自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等为氮素营养 异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮有机物为氮源 矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgS

2、O4、NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。许多天然成分的原料如牛肉膏、麦芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各种无机元素和生长因子，不需另外添加。 培养基分类 按物理状态分为 液体培养基 固体培养基 半固体培养基 液体培养基：用各种营养成分加水配成，或用天然物质的浸汁(麦芽汁、豆芽汁等)制成。组分均一，适宜各类微生物的营养生长。广泛应用于实验研究及大规模工业生产中，有利于广泛获得大量菌体或代谢产物。 固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制

3、成。市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98，凝固点42，1.52的水溶液在一般培养温度下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生物的分离培养、菌种鉴定和保藏。 新买来的琼脂要先试一下它的凝固能力，一般只要它能稳定地凝固住就不要多加。通常培养室温度较低时可适当少放一点，温度高时要多放一点。琼脂以颜色浅，透明度好，洁净的为上品。近来有些厂家生产琼脂粉，它比条状的使用更方便。同一厂家的产品，往往粉状的比条状的用量要少。 培养基简单来讲就是一种人工提供的生长环境，但人类提供这种环境的目的并不只是让其简单的生存，而是要

4、求其在生长、繁育的同时还要达到人类要求的质与量。 培养基中的物质配比是经过无数论证和实践的，与自然环境相比，营养物质是极度丰富的，可以让目标微生物达到“吃喝不愁”的“小康”状态。 培养基号 胨 5g 牛肉浸出粉 3g 磷酸氢二钾 3g 琼脂 15g 蒸馏水 1000ml PH7.88.0或6.56.6 胨：不同来源的蛋白质经部分酶解或酸水解后，得到的可溶性产物混合物，一般是（6003000D），主要作为微生物的培养基。牛肉膏即为主要碳源和能源 葡萄糖、蔗糖或麦芽糖、乳糖等单糖或双糖，有的可利用淀粉、纤维素等多糖为碳源和能源 1、将胨、牛肉浸出粉、磷酸氢二钾、琼脂加入约900ml的蒸馏水内，加热

5、并不断搅拌使完全溶解 2、加入预热过的蒸馏水定容至1000ml， 3、调PH使比最终PH略高0.20.4 4、过滤 5、分装灭菌锥形瓶 6、115 灭菌30min注意事项1、要通过预试验选择适当品牌的材料，确定琼脂的具体用量2、培养基中的葡萄糖和其他糖类要在其他成分配好，琼脂融化之后加入3、制成的培养基凝固后应透明，不得有沉淀。如果产生沉淀，应在培养基各成分配制好之后，趁热过滤后调PH，再分装消毒4、调PH宜为一次性，避免反复加酸、碱影响培养基质量5、配制好的培养基，使用期限为一个月，并贮存在冰箱中，分装培养基的容器应预先高压蒸汽灭菌30min. 待溶化的培养基稍冷却后，按配方要求调整pH值。

6、先取10毫升培养基装入试管中，用pH试纸测其自然pH，再用1NaOH(或1HCl)调至所需pH，根据用量计算，换用10NaOH(或10HCl)调整所配全量培养基的pH。加碱(或酸)溶液时，应边滴加边搅拌，至应加量将近用完时，再次测试，最后调至要求的pH值。 培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此 ，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去

7、，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至5560C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。 配好的培养基，根据需要趁热分装至试管或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的1/31/2；装试管一般为试管高度的1/51/4，以免灭菌时培养基上溢，粘湿棉塞。 用预先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。 最后用牛皮纸或报纸包住

8、棉塞，扎紧在瓶颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉塞或脱落。 培养基号 胨 6g 牛肉浸出粉 1.5g 酵母粉 6g 葡萄糖 1g 琼脂 1520g 蒸馏水 1000ml 中国药典2005年版二部附录的抗生素微生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，使用方便。临用时按照使用说明进行配制，但应注意核对培养基的PH，必要时需调节PH，使其符合规定。另外，市售干燥培养基的质量也存在差异，注意选择合适的产品。第二章 双碟的制备 双碟制备 双碟的制备应在半无菌室或洁净室内进行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培养基应在水浴中或微波炉内融化，避免直火加热。 底层用灭菌大口20ml吸管或其他灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml 注入双碟内，待凝固后更换干燥的陶瓦盖，放置于3537培养箱中保温，使菌层易于摊布。 双碟： 在抗生素效价测定中，装有培养基和试验菌的玻璃培养皿称为双碟。 分为底层（不含菌）和菌层。 双碟制备 1、倒底层 调整台面水平 已消毒的培养皿单个摆开 水浴融化培养基，室温冷至70， 大口灭菌刻度吸管迅速吸取20ML培养基，注入各个培养皿，均匀摊布，盖上干燥的陶瓦圆盖，待凝固。 2、倒菌层 从冰箱中取出菌液，回温 菌液加入融化后的培养基中，摇匀，不得有气泡 吸取含菌培养基5ml，注入已倒了底层的培养基表面，均匀摊布，盖上陶瓦圆盖，凝固即