翻译对反转录病毒的RNA干扰

1、对反转录病毒的RNA干扰Wen-Yuan Hu, Frederic D. Bushman, Amara C. Siva摘要：Bang和Ellerman以及后来Peyton Rous报道了第一次对传染性致癌因子的鉴定，这个因子后来发现是禽反转录病毒。今天，禽反转录度病毒是研究反转录病毒的复制和致病性的重要模型，并且是家禽的重要性病原。在这里，我们描述了在活鸡胚中使用RNA干扰（RNAi）来阻止禽反转录病毒的复制。我们也描述了在细胞培养时用RNAi对ASLV及HIV复制的抑制。关键词：反转录病毒 RNA干扰，siRNA，ASLV，HIV1、 综述RNAi是dsRNA(双股RNA）以一种序列特异性方

2、式促发了基因的沉默表达过程。已经在很多种生物体内观察到了，例如：植物、原生动物、线虫、真菌、昆虫和哺乳动物。机制的一些组分同样也参与了（：也叫小暂时性）的作用过程，s 是一类内源性带有发育基因（通过控制翻译抑制）的内源性非编码RNA分子。通过各种途径引入dsRNA能够诱发RNAi。这包括合成的内源性互补RNA链，通过感染病毒产生dsRNA，以及注入或者转染dsRNA。长的dsRNA被核糖核酸剪切酶三加工成大约21-23nt（核苷酸）长度的siRNA（小干扰RNA）（最近的RNAi机制评论请看Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D., Sharp, P.A., 2003. Ki

3、lling the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.4, 457467.。）另外，RNAi同样能够通过直接转染siRNA来诱导，这是一种模拟剪切过程产物的RNA。这些siRNA被结合到一个多组分RNA诱导的沉默复合体（RISC）上，并指导对靶mRNA的剪切和降解。在无脊椎动物，RNA沉默机制好像能偶增强降解信号。SiRNA的一条链结合到靶mRNA上能够明显的以引物的作用沿着靶RNA延伸互补RNA链，这是通过RNA依赖性聚合酶（）实现的。进一步对的加工结果产生了一代新的。然

4、而，迄今为止这种扩增在哺乳动物细胞中并没有观察到。1.2 在脊椎动物中的RNAi2001年前，将RNA应用于对脊椎动物病毒复制的抑制似乎没有可能性。众所周知，dsRNA能够诱导脊椎动物细胞产生干扰素反应。细胞对干扰素和dsRNA诱导物产生应答能够关闭翻译过程和一些其他的应答反应，这些应答反应能够阻止病毒复制也就能够阻止病毒在机体的散布。不过，Tuschl和Fire的实验室的关键发现表明dsRNA的长度能够决定应答反应的性质。长的ds诱导干扰素应答反应，短的诱导。这为研究对脊椎动物病毒的作用打开了一扇门。在植物中被发现是一种抗病毒应答反应。抑制了的植物在感染了一些病毒后会变现出症状加剧的现象。另

5、外，一些植物病毒已经能够编码能够抵抗系统的蛋白质，这为是植物对抗感染的应答反应的说法提供了强有力的证据。最近，在（是一种感染昆虫的病毒）中检测到一种能够抑制的蛋白质，这意味着同样在昆虫中也防御病毒。抑制物，蛋白，已经发现能够阻止植物和无脊椎动物的沉默，并且能够功能上代替黄瓜花叶病毒的沉默蛋白的抑制物。Rnai是脊椎动物对病毒感染正常反应应答的一个组成部分吗？这个问题仍然没有得到解答。我们和其他人通过使用反转录病毒模型来模拟rnai对病毒复制的抑制已经研究了这个问题。此综述重点研究禽反转录病毒，因为我们有禽反转录病毒的体内模型。很多刊物同样也报道过HIV的抑制研究。下面我们首先介绍HIV的研究工

6、作，然后再介绍rnai对禽反转录病毒的研究。这些研究表明rnai能有在体内和培养细胞上抑制病毒复制，但是我们留下了一个问题没有得到回答，那就是关于它正常作用的问题。不考虑它的正常作用，在脊椎动物，rnai好像能减轻病毒致病性。2. 在细胞培养上rnai对HIV的干扰。Garrus等于2001年首先报道了在细胞培养上HIV-1复制的抑制现象。在这个研究中，Tsg101（一种参与空泡蛋白分选的蛋白）被揭示是HIV-1出芽所必须的，出芽要通过针对Tsg101 mRNA的RNA干扰。这个漂亮的研究使得用RNAi方法来抑制HIV复制的研究呈爆炸性增长（总结在表一）。很多HIV基因组RNA含有学的si的靶

7、位点，包括和l区域(编码病毒的结构蛋白)以及tat和rev调控蛋白的基因。病毒复制需要的细胞因子以及Tsg101的编码区域已经都明确了，尤其是受体和共同受体和（参考表一）。在这些研究中，我们使用了几种方法来起始。这些技术中的一些其实是第一次使用，不过，每一种都表明用来治疗感染是一种可行的方法。用化学合成的RNA来转染细胞这种方法是第一次用来传送RNAi，不过这种方法的不足之处表明由此一起的RNAi是暂时的，而且很多原代细胞并没有迅速的被转染。通过一个由RNA聚合酶III启动子（如H1和U6启动子）或者聚合酶II启动子（CMV)控制表达的编码短的发夹RNA的DNA载体，RNAi同样能够被投递表达

8、。病毒载体的使用已经有过报道，包括基于腺病毒相关病毒的载体，反转录病毒载体，和慢病毒属病毒载体。在宿主基因组内，这三种病毒有能够整合抑制结构的优点，因此，能够在细胞分化过程中允许抑制子的存在。对细胞培养禽反转录病毒的抑制3.1ASLV的历史Ellerman和Bang证实有一个过滤性因子是引起鸡造白细胞组织增生的病因，鸡造血白细胞组织增生是一种白血病/淋巴瘤。1911纽约的洛克菲勒研究所，Rous报道了这种鸡的非细胞传染的实性肿瘤。随后观察到，将RSV接种到鸡胚的绒尿囊膜能导致出现个别小肿瘤，这些肿瘤的数量和病毒的浓度有关。Temin和Rubin证实将鸡胚成纤维细胞用Rous肉瘤病毒培养能导致致

9、癌性转换，单一的病毒粒子能够诱导转染的细胞产生不连续的病灶。Temin后来在他的证实实验中用了具有反转录酶活性的禽反转录病毒。RSV的研究也导致了对由急性转化的逆转录病毒转化的致癌基因的细胞同源性的鉴定。3.2 RNAi对ASLV复制的抑制。我们用禽反转录病毒作为模型来研究RNAi对反转录病毒的复制的抑制。在这些研究中，si和转染到细胞的ASLV gag基因的两个序列匹配，一个是p19 matrix (MA)的编码区，一个是p12 nucleocapsid（NC）的编码区。最为一个模型，鸡的DF-1培养细胞已经研究过，并且的RCAS模式也使用过。RCAS是一种敲除了RSV的src致癌基因的有复

10、制能力的反转录病毒的载体。这种敲除了致癌基因的载体允许将新基因信息转入原来的位置。RCAS病毒可以通过感染DF-1 细胞引入，也可以通过转染RCAS原病毒。siRNA同时的通过共转染引入。在有特异性siRNA存在的条件下，通过监测p19 基质蛋白的蓄积，我们发现转染2天后RCAS病毒的上清培养产物明显减少了（90%）。分析传播感染的原病毒构成也发现连个siGAG RNAs 抑制了RCAS的复制。和控制的抑制一样，用siRNA处理过的抑制不相关蛋白或者阻止转染的培养中并没有表现出有意义的的抑制。这些数据文档表明RNA能有效的抑制的复制。早起抑制还是后期抑制？反转录病毒的生命周期中有个部分可以作为

11、RNAi潜在的靶位点。可能，进入的病毒RNA在完成反转录之前就已经被RNAi降解了，或者由整合的原病毒病毒转录而来的m和基因组在随后被裂解。几个不同的小组研究过攻击病毒这个问题，并出现了一些不同的描述。我们已经了和的这个问题。为了用整合的原病毒来建立一个后期表达模型，我们用抑制反转录病毒基因组的或者用对照 和ASLV和HIV基因组的DNA拷贝一起来转染。我们发现抑制子对两种病毒都有用。因此RNAi对抑制由DNA拷贝表达的病毒mRNA和基因组RNA有效，这建立了抑制后转录的病毒基因组模型。那RNAi在感染的早期抑制引入细胞的病毒RNA基因组是什么样的呢？也就早期病毒和细胞膜是什么样的？为了研究这

12、个步骤，我们用ASLV或者HIV感染了细胞，并且测定了早期反转录产物的产量。因为病毒RNA基因组是作为DNA合成的模板，我们推测进入的病毒的降解将导致病毒DNA积累的减少。然而，在ASLV和HIV,我们并没有见到明显的不同。因此得出结论：进入的病毒基因组并不是RNAi作用的底物。这个结论没有得到所有研究这个问题的研究者的认同。Cullen和他的同事发现进入的基因组可能是RNAi的底物，尽管不是和新合成的RNA那样有效的被用作底物。Stevenson和同事没有发现早、晚期RNA对RNAi的敏感性有太大的差别。这些不同的原因仍需确定。可能早期病毒核心的不同片段暴露程度是有差别的，因此，选择作用哪段

13、RNA序列决定于这些序列是否敏感。很有可能实验过程中的不同莫名其妙的导致了这个结果，用更多的实验来弄清这里面的不同将是一个非常有趣的事情。为什么进入的病毒RNA基因组对RNAi敏感性不高？一种可能性是：进入的病毒基因组RNA可能受到了病毒蛋白的保护，因此阻止了RNAi的作用机制。另外一种可能性是：进入的基因组RNA没有进入到存在RNAi机制的细胞区间。比如，如果RNAi机制存在于核糖体或者细胞核，那么进入的基因组RNA将不能遇到RNAi因子。据报道，RNAi机制和翻译因子eIF2c相关，这支持了这个观点。4在胚胎电穿孔模型中，RNAi对鸡反转录病毒的抑制4.1 在鸡胚中的RNAi鸡胚卵内电穿孔

14、实验提供了一个简单而又方便的研究系统，这个系统是用来研究基因在发育过程中的活性。卵内穿孔包括脊髓中央管内注入核酸并在低电压下（25v）进行5次短的方波（25ms每次）电穿孔。核酸通过阳性电穿孔进入胚胎的一边。另外一半胚胎并没有进行电穿孔可以作为对照。在先前的研究中，通过电穿孔构建进鸡胚内的显性负基因使我们能分析发育脊髓中脊椎动物基因的作用。我们发现通过电穿孔，RNAi在鸡胚脊髓椎中能很容易诱导。这能够用来证实在卵内对反转录病毒复制的。等通过卵内电穿孔证实了的使用。起初，我们用作为靶目标来研究是否发生在鸡胚中。一个由编码的质粒和要么特异性（）或者非特异性（作用虫荧光素酶的）。电穿孔两天后，在有和

15、对照siRNA存在的条件下，在靠近阳性电穿孔的脊髓细胞中检测到了亮绿色的细胞。在有gfp质粒和siGFP存在的电穿孔胚胎，我们发现GFP表达减少了至少90%。超过3g/l siRNA电穿孔并没有对胚胎发育表现出干扰。这些研究和Pekarik团的成员证实RNAi能够操作鸡脊髓的发育。4.2 卵内电穿孔对ALV感染的抑制。为了研究RNAi是否能够抑制胚内RCAS的复制，我们用了两个已经证明在细胞培养中有活性的抑制gag基因的siRNA。si作为非特异性对照。受精两天后，鸡胚用一个编码基因组和进行电穿孔。第四天将鸡胚切片染色让后用抗 蛋白的p19 抗体来分析。只用了RCAS DNA而没有加入siRN

16、A或者对照siRNA的电穿孔导致了病毒从电穿孔的一半脊髓扩散到了间充质（由于第二次感染）。超过90%的ASLV复制被并两个siRNA（针对gag）中任意一个抑制了，因为通过抗Gag只有少数细胞有明显的感染。这些结果表明RNAi在鸡胚中能有抑制ASLV的复制。4.3 抑制RSV的致病性。接下来我们想知道在鸡胚模型中RNAi是否能够抑制RSV的转染。RSV编码致癌基因src，这个基因能够扰乱信号转导并能引起鸡肉瘤。我们用不同的siRNA和编码RSV的DNA用电穿孔转入鸡胚。三天后发现，用RSV和对照siRNA的鸡胚没有一个存活。相反，用siGAG处理过的鸡胚中，12个中有7个存活。为了研究RNAi

17、对RSV致病力的效果，在电穿孔后36h，用不同的抗体染色鸡胚切片。用mpm2的单克隆抗体检测到了M期的磷酸化，从而鉴定有丝分裂细胞，并且kip1染色鉴定细胞周期进程的抑制表明细胞停留在G1期。Gag（p19）抗体可以用来检测RSV的传播。在RSV感染的鸡胚，在电穿孔的那一半，神经管被分解了而且正常的细胞周期进程也受到了扰乱。在对照中，当RSV复制被RNAi抑制后，正常发育和正常控制的细胞周期进程可以看得到。因而证明了致病性受到了抑制。5RNAi在抑制动物反转录病毒上的应用。今天，在禽养殖业禽反转录病毒是一个非常严重的问题。禽养殖场的集约化条件是流行性传染疾病传播理想的条件，而且反转录病毒仍然是

18、个突出的威胁。疫苗大多没有什么效果，所以需要新的措施来应对由禽反转录病毒引起的疾病。对农业有意义的三个主要的致病性禽反转录病毒是：ASLV,REV,LPDV。ASLV可以根据受体取向性分为6个亚型，A-E和J。这些亚型中，A,B和J经常发生。尽管在一些鸡中发现了对A-E的遗传抗性，不过所有品种的鸡都对亚型J易感。ALV-J能够诱导造髓细胞组织增生，这是一种能诱导来至骨髓的白细胞发生肿瘤的感染。对禽养殖来说控制ALV-J是一个大问题，因为由在ALV-J爆发严重的时候会有高达20%-40%的种禽损失。反转录病毒的REV家族能引起各种各样的疾病包括鸡、鸭、火鸡、鹅、雉鸡和鹧鸪的慢性淋巴瘤。LPDV感

19、染能引起淋巴组织增生性疾病。而且，在美国发现一些引起鸡痘爆发的痘病毒基因组中含有完整的REV前病毒。显然REV使用痘病毒基因组而不是宿主基因组作为整合的靶基因，这样就把痘病毒的基因组整合到了痘病毒基因组中了。增加进痘病毒基因组的REV和痘病毒在宿主复制的增加有关，而且使得事先免疫过的禽类更容易感染。我们有一种抑制禽反转录病毒疾病的潜在的有吸引力的技术，就是在种系中插入一种针对反转录病毒序列或者和感染过程无关的宿主蛋白RNAi结构。举个例子，上述介绍过的用来起始针对gag靶基因的RNAi的DNA发夹可以放进鸡的基因组中，如果成功，将可以应用来抑制很多家畜的病毒感染和发病。RNAi在人的HIV上也

20、在研究，但是将RNAi开发成药物好像很难。相反，在短期内对家畜的种系改造看来是可行的。总之，RNAi好像会成为一种有希望的新的防治反转录病毒的新技术。这是一篇从头到尾都很好的综述。参考文献Al-Kaff, N.S., Covey, S.N., Kreike, M.M., Page, A.M., Pinder, R., Dale,P.J., 1998. Transcriptional and posttranscriptional plant gene silencingin response to a pathogen. Science 279, 21132115.Banerjea, A.,

21、Li, M.J., Bauer, G., Remling, L., Lee, N.S., Rossi, J., Akkina,R., 2003. Inhibition of HIV-1 by lentiviral vector-transduced siRNAs inT lymphocytes differentiated in SCID-hu mice and CD34+ progenitorcell-derived macrophages. Mol. Ther. 8, 6271.Bishop, J.M., 1991. Molecular themes in oncogenesis. Cel

22、l 64, 235248.Bushman, F.D., 2003. RNA interference: applications in vertebrates. Mol.Ther. 7, 910.Caplen, N.J., Fleenor, J., Fire, A., Morgan, R.A., 2000. dsRNA-mediatedgene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model forthe analysis of RNA interference. Gene 252, 95105.Caplen, N.

23、J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R.A., 2001. Specificinhibition of gene expression by small double-stranded RNAs ininvertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98,97429747.Capodici, J., Kariko, K.,Weissman, D., 2002. Inhibition of HIV-1 infectionby small interferin

24、g RNA-mediated RNA interference. J. Immunol.169, 51965201.Carmell, M.A., Xuan, Z., Zhang, M.Q., Hannon, G.J., 2002. The Argonautefamily: tentacles that reach into RNAi, developmental control,stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 27332742.Caudy, A.A., Ketting, R.F., Hammond, S.M.,

25、Denli, A.M., Bathoorn,A.M., Tops, B.B.J., Silva, J.M., Myers, M.M., Hannon, G.J., Plasterk,R.H.A., 2003. A micrococcal nuclease homologue in RNAi effectorcomplexes. Nature 425, 411415.Coburn, G.A., Cullen, B.R., 2002. Potent and specific inhibition of humanimmunodeficiency virus type 1 replication b

26、y RNA interference. J.Virol. 76, 92259231.Cogoni, C., Macino, G., 1999. Gene silencing in Neurospora crassarequires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase.Nature 399, 166169.Doench, J.G., Petersen, C.P., Sharp, P.A., 2003. siRNAs can function asmiRNAs. Genes Dev. 17, 438442.Doi, N., Ze

27、nno, S., Ueda, R., Ohki-Hamazaki, H., Ui-Tei, K., Saigo, K.,2003. Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammaliancells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors. Curr. Biol.13, 4146.Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D., Sharp, P.A., 2003. Killing the messenger:short RNAs that silen

28、ce gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.4, 457467.Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl,T., 2001a. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interferencein cultured mammalian cells. Nature 411, 494498.Elbashir, S.M., Lendeckel, W., Tuschl, T., 2001b. RNA i

29、nterference ismediated by 21 and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188200.Ellerman, V., Bang, O., 1908. Experimentelle Leukamie bei Huhnern.Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infectionskr. Hyg. Abt. Orig. 46,595609.Federspiel, M.J., Hughes, S.H., 1997. Retroviral gene delivery. MethodsCell. Biol. 5

30、2, 179214.Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., Mello,C.C., 1998. Potent and specific genetic interference by double-strandedRNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806811.Garrus, J.E., von Schwedler, U.K., Pornillos, O.W., Morham, S.G., Zavitz,K.H., Wang, H.E., Wettstei

31、n, D.A., Stray, K.M., Cote, M., Rich, R.L.,Myszka, D.G., Sundquist, W.I., 2001. Tsg101 and the vacuolar proteinsorting pathway are essential for hiv-1 budding. Cell 107, 5565.Hamilton, A.J., Baulcombe, D.C., 1999. A species of small antisense RNAin posttranscriptional gene silencing in plants. Scien

32、ce 286, 950952.Hammond, S.M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G.J., 2000. AnRNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing inDrosophila cells. Nature 404, 293296.Hu, W.Y., Meyers, C.P., Kilzer, J.M., Pfaff, S.L., Bushman, F.D., 2002.Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA

33、interference. Curr. Biol.12, 13011311.Hughes, S.H., Greenhouse, J.J., Petropoulos, C.J., Sutrave, P., 1987.Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA intohelper-independent retroviral vectors. J. Virol. 61, 30043012.Jacque, J.M., Triques, K., Stevenson, M., 2002. Modulation of HIV-1repli

34、cation by RNA interference. Nature 418, 435438.Jorgensen, R., 1990. Altered gene expression in plants due to transinteractions between homologous genes. Trends Biotechnol. 8, 340344.Keogh, E.V., 1938. Ectodermal lesions produced by the virus of Roussarcoma. Br. J. Exp. Pathol. 19, 19.Kim, T.J., Trip

35、athy, D.N., 2001. Reticuloendotheliosis virus integration inthe fowl poxvirus genome: not a recent event. Avian Dis. 45, 639663.Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.J., Ehsani, A., Salvaterra,P., Rossi, J., 2002. Expression of small interfering RNAs targetedagainst HIV-1 rev transcripts

36、in human cells. Nat. Biotechnol. 20,500505.Li, H., Li, W.X., Ding, S.W., 2002. Induction and suppression of RNAsilencing by an animal virus. Science 296, 13191321.Li, M.J., Bauer, G., Michienzi, A., Yee, J.K., Lee, N.S., Kim, J., Li,S., Castanotto, D., Zaia, J., Rossi, J.J., 2003. Inhibition of HIV-

37、164 W.-Y. Hu et al. / Virus Research 102 (2004) 5964infection by lentiviral vectors expressing Pol III-promoted anti-HIVRNAs. Mol. Ther. 8, 196206.Lipardi, C., Wei, Q., Paterson, B.M., 2001. RNAi as random degradativePCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs

38、. Cell 107, 297307.Marathe, R., Anandalakshmi, R., Smith, T.H., Pruss, G.J., Vance, V.B.,2000. RNA viruses as inducers. Plant Mol. Biol. 43, 295306.Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Luhrmann, R., Tuschl, T.,2002a. Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavagein RNAi. Cell 110,

39、 563574.Martinez, M.A., Gutierrez, A., Armand-Ugon, M., Blanco, J., Parera, M.,Gomez, J., Clotet, B., Este, J.A., 2002b. Suppression of chemokinereceptor expression by RNA interference allows for inhibition ofHIV-1 replication. AIDS 16, 23852390.Nakamura, H., Funahashi, J., 2001. Introduction of DNA

40、 into chickembryos by in ovo electroporation. Methods 24, 4348.Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., Ullu, E., 1998. Double-stranded RNAinduces mRNA degradation in Trypanosoma brucei. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 95, 1468714692.Novina, C.D., Murray, M.F., Dykxhoorn, D.M., Beresford, P.J., Riess, J.,Lee, S

41、.K., Collman, R.G., Lieberman, J., Shankar, P., Sharp, P.A.,2002. siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection. Nat. Med. 8,681686.Palatnik, J.F., Allen, E., Wu, X., Schommer, C., Schwab, R., Carrington,J.C., Weigel, D., 2003. Control of leaf morphogenesis by microRNAs.Nature 425, 257263.Park, W.S.,

42、 Miyano-Kurosaki, N., Hayafune, M., Nakajima, E., Matsuzaki,T., Shimada, F., Takaku, H., 2002. Prevention of HIV-1 infection inhuman peripheral blood mononuclear cells by specific RNA interference.Nucleic Acids Res. 30, 48304835.Payne, L.N., 1998. Retrovirus-induced disease in poultry. Poult. Sci. 7

43、7,12041212.Pekarik, V., Bourikas, D., Miglino, N., Joset, P., Preiswerk, S., Stoeckli,E.T., 2003. Screening for gene function in chicken embryo usingRNAi and electroporation. Nat. Biotechnol. 21, 9396.Pickford, A.S., Cogoni, C., 2003. RNA-mediated gene silencing. CellMol. Life Sci. 60, 871882.Plaste

44、rk, R.H., 2002. RNA silencing: the genomes immune system. Science296, 12631265.Qin, X.F., An, D.S., Chen, I.S., Baltimore, D., 2003. Inhibiting HIV-1infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of smallinterfering RNA against CCR5. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100,183188.Ratcliff, F.G

45、., MacFarlane, S.A., Baulcombe, D.C., 1999. Gene silencingwithout DNA. RNA-mediated cross-protection between viruses. PlantCell 11, 12071216.Romano, N., Macino, G., 1992. Quelling: transient inactivation of geneexpression in Neurospora crassa by transformation with homologoussequences. Mol. Microbio

46、l. 6, 33433353.Rous, P., 1911. A sarcoma of the fowl transmissible by an agent separablefrom the tumor cells. J. Exp. Med. 13, 397411.Sasaki, T., Shiohama, A., Minoshima, S., Shimizu, N., 2003. Identificationof eight members of the Argonaute family in the human genome smallstar, filled. Genomics 82, 323330.Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Haley, B., Zamore, P.D., 2002. Evidencethat siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila andhuman RNAi pathways. Mol. Cell. 10, 537548.Sijen, T., Fleenor, J.,