黄芪汤对糖尿病肾病小鼠信号通路的影响_图文

1、实验中医DOI :1016306/j1008-861x201605012黄芪汤对糖尿病肾病小鼠AMPK-Camkk (LKB1信号通路的影响陈霞1,彭文1,曹爱丽21上海中医药大学附属普陀医院肾内科(上海2000622上海中医药大学附属普陀医院肾内科专科实验室(上海200062【摘要】目的:探讨黄芪汤改善糖尿病肾病的作用及可能的机制。方法:40只6周龄db /db 小鼠随机分为模型组及黄芪汤高、中、低剂量组,每组10只,10只6周龄db /m 小鼠作为正常对照组。模型组、正常组均予05%羧甲基纤维素钠灌胃;各药物组分别予黄芪汤108g /kg 、036g /kg 、012g /kg 灌胃。1次

2、/d ,灌胃14周后进行生化指标、肾组织病理学检测,Western blot 检测各组肾皮质中AMPK-Camkk (LKB1信号通路相关蛋白的表达量。结果:与模型组比较,黄芪汤能降低db /db 小鼠的体质量、肾质量、血清三酰甘油(TG 、胆固醇(TC 、低密度脂蛋白(LDL-C 浓度,降低血清谷氨酸转氨酶(ALT 、谷草转氨酶(AST 浓度,升高肾质量/体质量指数(P 005,改善肾脏病理情况;上调肾皮质中p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表达量(P 005。结论:黄芪汤通过有效活化AMPK-Camkk (LKB1信号通路改善糖尿病肾病。【关键词】黄芪汤;AM

3、PK-Camkk (LKB1信号通路;db /db 小鼠;糖尿病肾病基金项目国家自然科学基金面上项目(81473480;国家自然科学基金青年科学基金项目(81400728作者简介陈霞,女,在读博士生,主要从事中西医结合防治慢性肾病的临床与基础研究通讯作者彭文,教授,博士生导师;E-mail :pengwen_011sinacom2型糖尿病常伴有脂代谢紊乱,而脂代谢异常与糖尿病肾病的发生和发展密切相关1。血脂升高加速活性氧自由基的产生,诱导肾小球硬化症和小管间质性损伤。越来越多的实验证实脂代谢紊乱与糖尿病肾病关系密切,但脂类物质在加重2型糖尿病肾病损伤方面的具体作用及机制目前尚不清楚2。黄芪汤出

4、自北宋杨士嬴仁斋直指方论卷十七,由黄芪、茯苓、瓜蒌根、麦门冬、北五味子、炙甘草及生地黄七味药组成,有补气养阴之功效。本研究通过糖尿病肾病动物模型,从AMPK-Camkk (LKB1信号通路入手,观察黄芪汤对2型糖尿病肾病小鼠生理生化指标、肾脏病理及肾皮质相关蛋白表达水平的作用,为黄芪汤治疗糖尿病肾病提供坚实的理论基础。1材料与方法11实验材料111动物6周龄雄性db /db 小鼠40只,体质量(352g ;db /m 小鼠10只,体质量(232g 。均购于南京大学南京生物医药研究院,动物合格证号:SCXK 沪2003-0002,SPF 级饲养。112药品和试剂黄芪汤所有生药均购自上海华宇药业有

5、限公司,其中黄芪(批号H20130318062kg 、茯苓(批号H20120820012kg 、瓜蒌根(批号H20110117062kg 、麦门冬(批号H20121016042kg 、北五味子(批号H20130503031kg 、炙甘草(批号H20130529011kg 、生干地黄(批号H20120918013kg ,共计13kg ,浓缩干燥,得干浸膏1730g ,检测浸膏得率为133%。抗体AMPK 、p-AMPK 、LKB1、p-LKB1购于Abcam (Cambridge ,MA ,USA ;ACC 、p-ACC 、p-Camkk 、Camkk 、GAPDH 以及羊抗兔、羊抗鼠二抗购自C

6、ell Signaling Technology (Danvers ,MA ,USA 。三酰甘油(TG 检测试剂盒、谷氨酸转氨酶(ALT 、谷草转氨酶(AST 检测试剂盒购于Sigma-Aldrich (St Louis ,MO ;低密度脂蛋白(LDL-C /VLDL 试剂盒购于Abcam (Cambridge ,MA,USA。113实验仪器血糖仪及其配套试纸购于德国Bayer公司(sn2751665,酶标仪购于美国Bio-ad 公司(VAIOSKAN FLASH,全自动生化检测仪购于瑞士Cobas公司,Image Lab TM图像采集和分析软件购于美国Bio-ad公司。12动物分组和干预40

7、只6周龄db/db小鼠随机分为模型组,黄芪汤高、中、低剂量组,每组10只。分别给予05%羧甲基纤维素钠和黄芪汤108g/kg、036g/kg、012g/kg灌胃,1次/d。10只6周龄db/m小鼠作为正常对照组,给予05%羧甲基纤维素钠灌胃,1次/d。均连续干预14周。13标本处理及检测方法干预结束后次日早晨空腹先行眼球取血;后取左侧肾脏,剥去包膜,由矢状面切开分成两部分,第一部分用10%福尔马林浸泡用于病理检测,第二部分于80低温保存用于检测蛋白。131生化指标检测用试纸法检测小鼠血糖,并称量小鼠体质量和肾质量,小鼠血清TG、胆固醇(TC、LDL-C、ALT、AST分别用试剂盒检测。24h

8、尿蛋白定量用全自动生化检测仪检测。132组织学检测10%中性福尔马林中固定肾脏组织,石蜡包埋,切片,行PAS染色。400倍光镜下观察肾组织形态学改变。PAS染色由上海中医药大学附属普陀区中心医院病理科协助完成。133Western blot检测组织蛋白样本(上样量为20g采用SDS-PAGE胶分离,5%BSA封闭,加入一抗AMPK(11000稀释,Camkk(11000稀释,LKB1(11000稀释,ACC(11000稀释,p-AMPK(11000稀释,p-Camkk(11000稀释, p-LKB1(11000稀释,p-ACC(1800稀释, GAPDH(11000稀释,4孵育过夜,洗膜,加入

9、二抗孵育1h,TBST洗膜,滴加ECL显影液显影。目的条带采用Image J软件进行灰度值分析。14统计学方法用GraphPad Prism50Software (GraphPad Prism Software Inc,San Diego,Calif, USA软件进行统计分析,计量资料组间比较采用t检验,多组之间的比较采用One-Way ANOVA单因素方差分析;P005为差异有统计学意义。2结果21对db/db小鼠肾质量、体质量、肾质量/体质量指数的影响模型组小鼠肾质量、体质量明显高于正常组(P001,黄芪汤各剂量组肾质量、体质量较模型组明显降低(P005,P001,且呈浓度依赖性。模型组小

10、鼠肾质量/体质量指数明显低于正常组,黄芪汤各剂量组较模型组明显升高(P005,P001。见表1。表1各组小鼠体质量、肾质量、肾质量/体质量指数比较(xs组别n体质量(g肾质量(g肾质量/体质量正常组102636167016001685008模型组104718547*023001*407008*黄芪汤高剂量组103854473#017002#570046#黄芪汤中剂量组104216295#018002#551128#黄芪汤低剂量组104380527#020002#461049#注:与正常组比较,*P001;与模型组比较,#P005,#P00122对小鼠血糖及24h尿蛋白浓度的影响模型组小鼠血糖及

11、24h尿蛋白浓度明显高于正常组(P001,黄芪汤各剂量组血糖及24h尿蛋白浓度较模型组明显降低(P001。见表2。表2各组小鼠血糖、24h尿蛋白比较(xs组别n血糖(mmol/L24h尿蛋白(g/L正常组10710122119107模型组103210305*2933153*黄芪汤高剂量组101066361#1056138#黄芪汤中剂量组101474358#1567351#黄芪汤低剂量组102034724#2067451#注:与正常组比较,*P001;与模型组比较,#P00123对小鼠血清血脂水平的影响结果显示,模型组小鼠TC、TG、ALT、AST明显高于正常组(P001, LDL-C则明显低于

12、正常组(P001;黄芪汤各剂量组TC、TG、ALT、AST较模型组明显降低(P005, P001,LDL-C明显高于模型组(P005, P001。见表3。24对小鼠肾脏病理学的影响经PAS染色观察,db/db小鼠肾小球囊内有充满均质红染的糖原物质,毛细血管基底膜增厚,系膜区明显增宽,内有红色的糖原物质,同时系膜基质增加;肾小管官腔内有红色的糖原物质沉积,上皮细胞肿胀、脱落。黄芪汤高、中、低给药组肾小球和肾小管有不同程度的改变,表现为肾小球囊内和系膜区糖原物质色淡,沉积减少。见图1。表3各组小鼠血清TC 、TG 、LDL-C 、ALT 、AST 水平比较(x s 组别n TG (mmol /L

13、TC (mmol /L LDL-C (mmol /L ALT (U /L AST (U /L 正常组1008902601600168500723663065203523模型组10367096*023001*407007*7333551*25400001*黄芪汤高剂量组10126073#017002#570046#4267473#9400200#黄芪汤中剂量组10161052#018002#551127#5466416#122003182#黄芪汤低剂量组10198042#020002#461049#6567153#165001277#注:与正常组比较,*P 001;与模型组比较,#P 005,#

14、P 0 01图1小鼠肾脏病理(PAS 染色,40025对小鼠肾皮质AMPK-Camkk (LKB1信号通路蛋白表达的影响Western blot 检测结果提示, 模型组p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表达显著低于正常组。黄芪汤各剂量组p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表达量呈浓度依赖性增加(P 005,P 001。见图2,表4。3讨论2型糖尿病是由于胰岛素分泌相对不足(胰岛素抵抗所引起,在临床上主要表现为多饮、多尿、多食及肥胖,糖尿病高血糖状态下,以肾组织中糖代谢紊乱为主的多种因素综合造成肾组织中活性氧簇(OS 产生过多,破坏肾组织

15、正常的清除能力,过多不稳定的OS 将与脂质、蛋白等分子相互作用,激活一系列细胞信号通路3。脂代谢紊乱是2型糖尿病最常见的病理改变之一,是各种并发症产生的重要危险因素。2型糖尿病中脂代谢异常对1:正常组;2:模型组;3:黄芪汤高剂量组;4:黄芪汤中剂量组;5:黄芪汤低剂量组图2各组小鼠AMPK-Camkk (LKB1信号通路蛋白表达电泳图(Western blot 表4各组小鼠AMPK-Camkk (LKB1信号通路蛋白表达的比较(n =7,x s 组别p-ACC p-AMPK p-Camkk p-LKB1正常组067026089020081012065017模型组036019*047016*0

16、39025*040012*黄芪汤高剂量组065016#076013#078011#060025#黄芪汤中剂量组057014#061012#070021#057027#黄芪汤低剂量组043021#050021051014#045019#注:与正常组比较,*P 001;与模型组比较,#P 005,#P 001糖代谢有重要影响4,长期糖脂代谢紊乱可以引起肾脏病理改变5。糖尿病肾病血糖升高的病理状态下能促使胆固醇调节元件结合蛋白(SEBP表达增加,同时SEBP引起TG、TC升高,进而TGF-1和VEGF不断增加,最终导致肾小球基质蛋白增多、肾小球硬化和肾小管纤维化。本研究发现黄芪汤可降低db/db小鼠

17、的血清TG、TC、LDL-C浓度,改善肾脏病理情况。血清ALT浓度增高是反映肝脏损害的重要指标,糖尿病病变一般伴随肝脏的氧化损伤6。糖尿病肝脏损伤具体病理机制可能为在高糖环境下,糖尿病小鼠肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD活性降低或失去活性,发生了非酶糖基化反应。不饱和脂肪酸受到氧自由基影响,造成肝细胞膜中磷脂发生过氧化分解7。肝细胞膜的通透性、流动性和膜蛋白变性、细胞膜受损、胞内酶外漏,导致血清ALT 和AST水平升高。大量研究报道,小鼠长期处于高血糖状态下,血清ALT的水平明显增高,最终将造成肝脏功能的损伤。因此ALT水平可反映肝功能受损的程度8。本研究发现黄芪汤可剂量依赖性的降低db/db

18、小鼠血清ALT、AST浓度,改善db/db 小鼠肝功能受损程度。糖尿病肾病的发病机制之一是脂代谢的紊乱。研究已表明,AMPK-Camkk(LKB1信号转导通路在脂代谢中起着非常重要的作用9-10。糖尿病是一种以胰岛素抵抗和细胞功能障碍为病机、以慢性高血糖为特征的代谢。其中TG和游离脂肪酸(FFA的升高,既造成胰岛素抵抗又造成细胞功能损害。糖尿病和脂代谢紊乱关系极其密切11。LKB1是腺苷酸激酶(AMPK上游的激酶,LKB1缺失可使AMPK功能下降。LKB1能在多种细胞内磷酸化和活化AMPK,调节机体代谢和细胞增殖。AMPK是动物细胞能量平衡的重要感受器,AMPK-亚基上存在一个特殊的苏氨酸残基

19、(Thr-1720,该位点可被LKB1磷酸化。AMPK蛋白被认为是脂肪代谢关键酶乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC的一个上游调节因子。ACC是一种促进脂肪酸合成的酶,其处于脂肪和糖代谢的一个交汇点,在脂肪和碳水化合物代谢中有重要作用12。Camkk是一种激活钙调素依赖蛋白激酶的激酶(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase,属于众多钙调蛋白激酶中的一员,可以激活AMPK。Camkk参与外周组织营养过剩时的代谢调节,在脂肪形成和肝细胞糖代谢中发挥重要作用13。AMPK是“细胞能量调节器”,在调节糖、脂代谢方

20、面起重要作用。AMPK作为一个重要的信号通路,通过参与细胞蛋白质合成、机体炎性反应和氧化应激等过程,在延缓糖尿病肾病的发生、发展中发挥了重要作用14。本实验研究发现通过黄芪汤作用于db/db小鼠,可以改善脂代谢紊乱,上调p-AMPK、p-Camkk、p-LKB1、p-ACC蛋白的表达。研究发现黄芪汤可降低db/db小鼠的体质量、肾质量,降低血清TG、TC、LDL-C浓度,降低血清ALT、AST浓度,升高肾质量/体质量指数,改善肾脏病理情况,可上调肾皮质足细胞中p-AMPK、p-Camkk、p-LKB1、p-ACC蛋白表达水平,从而激活2型糖尿病肾病诱导的AMPK-Camkk(LKB1信号通路。

21、提示黄芪汤能通过激活AMPK-Camkk(LKB1表达而延缓糖尿病肾病的进展,为黄芪汤应用于临床治疗糖尿病肾病提供科学的理论依据。参考文献:1Siddiqui S,Ahsan H,Khan M,et alProtective effects oftocotrienols against lipid-induced nephropathy in experimental type-2 diabetic rats by modulation in TGF-beta expressionJToxicol Appl Pharmacol,2013,273(2:314-3242Wesson DEMovin

22、g closer to an understanding of the hyperfiltrationof type2diabetes mellitusJAm J Physiolegul Integr Comp Physiol,2006,290(4:973-9793Monsénégo J,Mansouri A,Akkaoui M,et alEnhancing livermitochondrial fatty acid oxidation capacity in obese mice improves insulin sensitivity independently of

23、hepatic steatosisJJ Hepatol, 2012,56(3:632-6394Soto-Urquieta MG,López-Briones S,Pérez-Vázquez V,et alCurcumin restores mitochondrial functions and decreases lipid peroxidation in liver and kidneys of diabetic db/db miceJBiol es,2014,47(1:74-765孙峰俐,曹和欣,何立群糖肾宁对糖尿病肾病大鼠肾组织AGES和OS的影响J上海中医药

24、大学学报,2014,28(5:57-596Grove KJ,Voziyan PA,Spraggins JM,et alDiabetic nephropathyinduces alterations in the glomerular and tubule lipid profilesJJ Lipides,2014,55(7:1375-13857Zhang XD,Yan JW,Yan G,et alPharmacological inhibition ofdiacylglycerol acyltransferase1reduces body weight gain, hyperlipidemia

25、,and hepatic steatosis in db/db miceJActa Pharmacol Sin,2010,31(11:1470-14778Chu Y,Gómezosso L,Huang P,et alLiver Med23ablationimproves glucose and lipid metabolism through modulating FOXO1 activityJCelles,2014,24(10:1250-12659Seo MS,Kim JH,Kim HJ,et alHonokiol activates the LKB1-AMPK signaling

26、 pathway and attenuates the lipid accumulation in hepatocytesJJ Lipides,2015,284(2:113-12410He Z,Peng Y,Duan W,et alAspirin regulates hepatocellularlipid metabolism by activating AMPK signaling pathwayJJToxicol Sci,2015,40(1:127-13611Hosseinpanah F,Barzin M,Mirbolouk M,et alLipidaccumulation product

27、 and incident cardiovascular events in anormal weight population:Tehran Lipid and Glucose StudyJEur J Prev Cardiol,2015,23(2:187-19312Xie Z,Ding SQ,Shen YFSilibinin activates AMP-activatedprotein kinase to protect neuronal cells from oxygen and glucosedeprivation-re-oxygenationJBiochem Biophyses Com

28、mun,2014,454(2:313-31913Pyla,Osman I,Pichavaram P,et alMetformin exaggeratesphenylephrine-induced AMPK phosphorylation independent of CaMKKbeta and attenuates contractile response in endothelium-denuded rat aortaJBiochem Pharmacol,201492(2:266-27914Chang CC,Chang CY,Wu YT,et alesveratrol retardsprog

29、ression of diabetic nephropathy through modulations of oxidative stress,proinflammatory cytokines,and AMP-activated protein kinaseJJ Biomed Sci,2011,18(1:47-51编辑:沈蕾收稿日期:2016-03-08Influence of Huangqi Decoction on the AMPK-Camkk(LKB1 Signaling Pathway in Mice with Diabetic NephropathyCHEN Xia1,PENG W

30、en1,CAO Ai-li21Department of Nephrology,Putuo Hospital Affiliated to Shanghai Universityof Traditional Chinese Medicine,Shanghai,2000622Specialized Laboratory of Nephrology Department,Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai,200062ABSTACT Objective:To investigate the effect and possible mechanism of Huangqi Decoction(HQDon diabetic nephropathyMethods:Forty db/db mice of6weeks old were randomly divided into the model group treated with05% sodium carboxymethyl and HQD groups treated wi