肺癌组织中蛋白质组双向电泳图谱分析方法的建立-

1、热与抗肿瘤药物联合应用的优势是利用它们的互补作用,在减少化疗药物用量,降低热疗温度的情况下保持甚至提高疗效,作者认为紫杉醇具备上述优点,作为热化疗联合应用治疗口腔颌面部恶性肿瘤的首选化疗药物,有着广阔的前景。而对于39低药物浓度作用时出现肿瘤细胞增殖活性明显增加的现象国内外尚未见报道,其机制有待进一步研究。参考文献1刘宝林,顾晓明主编.口腔颌面外科学.沈阳:辽宁科技出版社,2000.2802韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1991.5193van der Zee J.Heating the patient:a p r om ising app r o

2、ach?Ann Oncol,2002,13(8:11734W ester mann AM,Gr osen E A,Katschinski D M ,et al .A p il otstudy of whole body hy perther m ia and carbop latin in p latinu m 2resistant ovarian cancer .Eur J Cancer,2001,37(9:11115Van Heek 2Romanowski R,Putter S,Trarbach T,et al .Et opo 2side t oxicity on human neur o

3、blast oma cells in vitr o is en 2hanced by p receeding hyperther m ia .Med Pediatr Oncol,2001,36(1:1976Monge OR,Rofstad EK,Kaalhus O.Ther moche motherapy invivo of a C3H mouse ma mmary carcinoma:sinigle fracti on heat and drug treat m ent .Eur J Cancer Clin Oncol,1988,24(10:16617Stein U,Jurchott K,W

4、 alther W ,et al .Hyperther m ia in 2duced nuclear transl ocati on of transcri p ti on fact or Y B 21leads t o enhanced exp ressi on of multidrug resistance 2related ABC trans porters .J B i ol Che m,2001,276(30:285628Pazdur R,Kudelka AP,Kavanagh JJ,et al .The taxoids:pacli 2taxel (taxol and docetax

5、el (taxotere .Cancer Treat Rev,1993,19(4:3519Perez E A,Buck walter CA,Reid JP .Combinati ons of pacli 2taxel and et oposide in the treat m ent of lung cancer .Se m in Oncol,1996,23(6Supp l 15:2110Donehower RC,Rowinsky EK,Gr ochow LB,et al .Phase Itrial of taxol in patients with advanced cancer .Canc

6、er Treat Rep,1987,71(12:117111Jordan MA,T os o RJ,Thr o wer D,et al .Mechanis m of m it oticbl ock and inhibit or of cell p r oliferati on by tax ol at l o w concen 2trati on .Pr oc Natl Acad Sci US A,1993,90(20:955212U rano M ,Kur oda M ,N ishi m ura Y .For the clinical app lica 2ti on of ther moch

7、e motherapy given at m ild te mperatures .I nt J Hyperthe m ia,1999,15(2:7913KappelM ,Stadeager C,Tvede N,et al .Effects of in vivohyperther m ia on natural killer cell activity,in vitr o p r olifera 2tive res ponses and bl ood mononuclear cell subpopulati ons .Clin Exp I m munol,1991,84(1:175(20052

8、03210收稿责任编辑姜春霞3河南省自然科学基金资助项目004022300;211工程重点项目肿瘤与生物子项目肺癌组织中蛋白质组双向电泳图谱分析方法的建立3张慧珍1范清堂1吴逸明21郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室郑州4500522郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州450052男,59岁,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤分子生物学关键词双向电泳;图谱分析;蛋白质组;P DQuest 软件;肺肿瘤中图分类号Q503摘要目的:建立一套双向凝胶电泳图像的分析方法,为进一步分析和鉴定差异蛋白奠定基础。方法:提取肺癌组织和癌旁组织中的可溶性总蛋白,进行双向凝胶电泳,电泳图片由专用扫描仪获取后,

9、应用图像分析软件(P DQuest 7.1进行蛋白差异点的表达情况分析。结果:二维电泳图片经过背景消减、点检测、点匹配等一系列分析后,得出了差异点。结论:P DQuest 7.1软件可以用来快速有效地对生物样品之间蛋白质的差异进行分析。Analysis method of t w o 2di m ensi onal gel electr ophoresis i m ages614郑州大学学报(医学版2005年5月第40卷第3期ZHAN G Huizhen1,FAN Q ingtang1,WU Yi m ing21D epart m ent of Environm enta l Health,C

10、ollege of Public Health,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou4500522D epart m ent of O ccupational Health and Toxicology,College of Public Health,Zhengzhou U niversity, Zhengzhou450052Key wordst w o2di m ensi onal gel electr ophoresis;i m age analysis;p r oteome;P DQuest s oft w are;lung neop las mAbstrac

11、tA i m:T o establish a t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis i m age analysis method f or analyzing the differenti2 ally exp ressed p r oteins.M e tho d s:The whole s oluble p r oteins of tissue of lung cancer and the contr ols were extracted by one step and separated using22di m ensi onal gel e

12、lectr ophoresis.Acquire the i m age and analyze the i m ages using the s oft w are P DQuest7.1.R e su lts:After the backgr ound subtracti on,s pot detecti on and matching,the p r otein s pots which exp ressed differentially were obtained.Co nc l u s i o n:The results of di m ensi onal gel electr oph

13、oresis can be ananlyzed quickly and con2 veniently using P DQuest7.1gel i m age analysis s oft w are.蛋白质组学的核心技术双向电泳是目前惟一能将数千种蛋白质同时分离与展示的技术,在蛋白质组的研究中发挥着重要作用1。其基本思路就是将生物样品中的蛋白质按照所需方法提取出来,通过等电聚焦电泳和十二烷基磺酸2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2P AGE将样品的所有蛋白在一块凝胶上显现出来,通过图像获取技术获得图像2。那么如何有效地对二维电泳图像进行分析,挖掘有价值的蛋白质信息便成了一个倍受关注的问题。作者通

14、过研究肺癌组织和癌旁组织之间蛋白的差异情况,采用P DQuest7.1软件摸索建立了一套成熟的二维电泳图像分析方法,为下一步对感兴趣的蛋白差异点的质谱鉴定奠定基础。1材料与方法1.1标本的收集和蛋白质的提取实验采用的肺癌组织和配对的癌旁组织标本均取自郑州大学第一附属医院,经病理学鉴定。提取组织总蛋白3,B radford方法检测蛋白浓度4,-80保存备用。1.2固相pH梯度2S D S双向凝胶电泳使用B I O2 RAD公司的双向电泳仪。第一相等电聚焦使用的预制胶条pH310。样品100g中加入上样缓冲液,总的vh为80000。第二相S DS2P AGE电泳使用120g/L凝胶。考马斯亮蓝染色

15、。1.3图像采集与分析软件使用GS2800获取图像后,用P DQuest7.1软件对图像进行剪切、编辑、点检测、点匹配。2结果2.1图像获取利用P DQuest软件内部支持的图像扫描装置GS2800进行图像的获取。2.2图像的调整和背景的消减利用I m age菜单中的剪切(cr op和旋转(r otate功能匹配不同的凝胶所需要的相同尺寸大小和形状的图像。在“Transf or m”命令中通过自动或手动最大限度地消减背景,以避免这些背景对二维电泳图像的分析和实验结果的分析的影响。2.3点的检测和编辑利用软件中“Spot”菜单的“Spot Detecti on W izard”中的Faint S

16、pot butt on、S mall Spot butt on、Large Spot butt on命令选择适当的点,软件系统自动设置检测参数,点击Spot Detecti on but2 t on后系统会自动进行点检测。点检测完成后可以直接修改检测的结果,调整密度值、点的面积和最低峰值等参数直至检测出凝胶上所有感兴趣的点。点检测时还可通过设置参数消除电泳过程中出现的横纹和竖纹,使蛋白质呈点状分布。点检测后图像上所有的点的中心都可用十字线表示。点检测的参数保存在系统中,用相同方法电泳、染色、扫描得到的图像可用相同的参数进行检测。点检测的同时可以对点进行编辑,例如删除一些杂质斑点、手工添加一些点

17、、手工合成和分割一些点等等。点检测完成后,每个蛋白点的编号、峰值、量值和位置都可以显示出来。凝胶扫描图像经过点检测后蛋白点会变得更加清晰,而且分析系统还会自动从清晰的点中建立三维的高斯点。经过过滤、检测后,二维图像就会有三个独立的图像:原始扫描图、过滤图、高斯图。2.4点匹配点检测完成后,软件系统会自动提示进行匹配(Match。匹配前首先是选择要比较的一组胶创建Matchest,并选择一个点较多、能代表整个实验的,并且胶上的点分布较好、清晰的胶作为标准胶(matchset standard的模板。匹配时要设立标志点(land mark s pots,P DQuest将landmark s po

18、ts作为参照点去调整和定位自动匹配的胶,用于弥补胶成员之间轻微的不同和变形。标志点应该选择分辨良好且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点,并尽量避开蛋白质聚集的地方,最好在不同的放大倍数下714Journal of Zhengzhou University(M edical SciencesM ay.2005Vol.40No.3确定该蛋白质斑点为所有成员胶上的同一个蛋白质斑点。设立两个以上蛋白质标志点后,便可进行不同凝胶上蛋白质斑点之间的匹配了,在标准胶中的字母表示这些点在其它胶中已被匹配到。P DQuest 软件还可以用手工方式编辑误配的或将没有匹配到的点进行手工匹配。肺癌与癌旁组织可溶性蛋白双向

19、电泳匹配结果见图1 。图1肺癌与癌旁组织可溶性蛋白双向电泳匹配结果A:癌旁组织;B:肺癌组织2.5数据分析在比较双向凝胶图谱时,经常有一些由于样品处理、染色、成像的不同而引起的差异,这些变化不是由蛋白表达引起的。因此要准确定量比较,就必须通过归一化(Nor malizati on 来弥补这些非表达性的误差。P DQuest 有几种归一化的方法,其中最有效的方法是确定胶之间保守的蛋白,即这些蛋白在所有的胶中都存在且数量变化不大。在P DQuest 中用Analysis Sets 工具可创建多个Analysis Sets 系统,作者利用Analysis Sets 系统,比较分析肺癌和癌旁胶之间变化量超过五倍的蛋白质点,符合条件的点在胶上标出(图2 。图2肺癌与癌旁蛋白表达量差异分析A:肺癌高5倍表达的蛋白点;B:肺癌低5倍表达的蛋白点2.6结果输出完成分析工作后,可以根据自己的需要将实验数据以图像、表格、图表、数字或文字的形式输出。3讨论3.1实验的重复性与数据的可靠性重复性和可靠性是双向电泳技术的关键点。实验中经常由上样、染色等人为因素引起一些非蛋白表达的差异,直接影响到实验数据的可比性。为了更准确地对不同凝胶上的蛋白点进行分析和比较,P DQuest 软件的归一化功能可弥补这些非表达性的误差,让细胞内表达水平一致