血片制作染色和血检质量控制

1、1一、血片制作一、血片制作血膜的制作血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称呈薄膜状，称薄薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。发热病人血片发热病人血片标本片标本片2 血膜的制作（取血时间）血膜的制作（取血时间）n取血时机取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。疟原虫作标本时，则应掌

2、握适宜的取血时机。 间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；利时机；3648小时，可检出裂殖体；发作小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。一、二次后，配子体出现较多。n恶性疟较理想的取血时间是在发作后至恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。3 血膜的制作（取血操作）血膜的制作（取血操作）n取血方法

3、取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血用采血针采血，通常在耳垂取血（现场取血用采血针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端消毒针迅速刺入耳垂下端12毫米，不宜毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。压出血。4 取血量及涂片法（

4、涂片操作）取血量及涂片法（涂片操作）n薄血膜薄血膜 取洁净的载玻片取洁净的载玻片2张，张，1张平置在桌上，以左张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分端边缘的中点从取血部分取约取约1微升的血量（相当于微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，滴与平置的载玻片接触，并形成并形成2530度夹角，待度夹角，待血液向两侧扩展约血液向两侧扩展约2厘

5、米长厘米长度时，均匀而迅速地轻轻度时，均匀而迅速地轻轻向 左 推 出 （ 约向 左 推 出 （ 约 2. 5厘 米厘 米长）。长）。5（涂片操作）（涂片操作） 厚血膜厚血膜 用推片的一用推片的一角，从取血部位刮取角，从取血部位刮取约约4微升血量（相当微升血量（相当于火柴头大小），使于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片血滴与平置的载玻片接触，再由里向外或接触，再由里向外或由外向里一个方向旋由外向里一个方向旋转，转转，转24圈，涂成圈，涂成直径直径0.81厘米大小厘米大小圆形厚血膜，血膜厚圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出落，过薄达不到检出率的要求。率的要求。

6、6血膜的制作血膜的制作（涂片操作）（涂片操作）n涂制厚、薄血膜的位置涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，等分，第第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第格前缘至第6格中部。格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个个；门诊和发热病人血片门诊和发热病人血片 涂涂2个厚血膜个厚血膜1个薄血膜，个薄血膜，以以 防血膜脱落而影响检查防血膜脱落而影响检查； 疟疾调查时，每张玻片疟疾调查

7、时，每张玻片 可涂制可涂制23人血膜。人血膜。7血膜的制作血膜的制作n血膜编号血膜编号 血膜制成后，立即用特种血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。标本盒内。8 制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项 1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产

8、生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。9制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项n 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段

9、时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。10制作制作血膜血膜的注意事项的注意事项n 3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能夏天标本尽可能2448小时内固定染色；小时内固定染色；冬天也不能超过冬天也不能超过72小时。放置时间越久，小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定不能及时染色，膜血膜

10、宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。后染色。11二、血片的染色二、血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染液种类染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称目前所用的血片染色液，虽然名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液两大类，前者包括罗氏、西氏（两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏氏染液等，后者包括利氏(

11、Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。这些染瑞氏和吉氏染液等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以称多色性染剂。氧化所成的天青，所以称多色性染剂。12血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染色原理：染色原理：伊红是伊红是酸性酸性水溶性钠盐，美兰是水溶性钠盐，美兰是碱性碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、性的阳离子，在遇到碱性的蛋

12、白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。染成兰色。#13血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理染色原理染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色

13、。天青虽然也是碱性染剂，但又能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。14血片的染色血片的染色（一）染液的种类及染色原理（一）染液的种类及染色原理注意注意：蛋白质是：蛋白质是二性二性电解质，当其处于较电解质，当其处于较等电点

14、等电点为酸的溶液中时，为酸的溶液中时，便呈硷的作用，即与酸结合便呈硷的作用，即与酸结合* ，这就说明为何在染液偏酸时，这就说明为何在染液偏酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆着色不著；反之，蛋白质在偏硷的溶液中呈酸的作用而中和硷着色不著；反之，蛋白质在偏硷的溶液中呈酸的作用而中和硷基，也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒基，也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫兰色。等被染成紫兰色。 伊红在水溶液内遇到美兰或天青，时间一长即可互相化合伊红在水溶液内遇到美兰或天青，时间一长即可互相化

15、合而产生沈淀从而失去染色力，因此，而产生沈淀从而失去染色力，因此，吉氏母液绝对不能进水吉氏母液绝对不能进水。15血片的染色血片的染色（二）吉氏染液母液配置方法（二）吉氏染液母液配置方法 取吉氏粉取吉氏粉0.5克置于研钵中，克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至至25毫升加完为止，倒入毫升加完为止，倒入60或或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至浓液混入瓶内，至25毫升甲醇毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于塞，充分摇匀

16、，置于5560水浴中或温箱内水浴中或温箱内24小时或室温小时或室温内内35天，多加摇动，即成原天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。可经久不变。 材料：材料： 1、吉氏粉、吉氏粉0.5克克 2、甘油、甘油25毫升毫升 3、甲醇、甲醇25毫升毫升16血片的染色血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红

17、蛋白，然后才进行染色。蛋白，然后才进行染色。 成批血片染色成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性毫升原液加中性蒸馏水蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。板上，待干镜

18、检。 17血片的染色血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。 单张血片染色单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，：薄血膜经固定干燥后，用用2%吉氏染液稀释液吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片毫升，滴入血片标本上染色标本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水分钟左右，或用中性蒸馏水1毫毫升，加吉氏母液升，加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血滴，混合均匀后滴入血片标本上，染

19、色片标本上，染色1020分钟，然后用清水轻分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。 18影响染色效果的因素影响染色效果的因素n血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：因素的影响：n（1）染料溶剂的质量）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必和中性甘

20、油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。须干净而无水份。19影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（2）染液的新旧）染液的新旧 新配制的染液因色素尚新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。20影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（3）染液稀释后使用时间）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红

21、和由美蓝氧化液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内一般在半小时内染色力最强。染色力最强。21影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（4）染液的稀释浓度）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏

22、酸，薛氏点不明显或则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。消失。22影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（5）染色时间）染色时间 染色时间长染色效果好，染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。气温而适当增减。23影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（6）染色用水）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用

23、的新鲜清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。冲洗血片予以纠正。24影响染色效果的因素影响染色效果的因素n（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻

24、冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。25三、发热病人血检的质量控制三、发热病人血检的质量控制n 19世纪后期，显微镜的出现世纪后期，显微镜的出现使人们不断发现了传染病的病因，使人们不断发现了传染病的病因，1880年法国军医拉韦朗年法国军医拉韦朗（Laveran）第一次见到并描述第一次见到并描述了人红细胞内的疟原虫，至此才了人红细胞内的疟原虫，至此才解开了困扰人们数千年的疟疾的解开了困扰人们数千年的疟疾的病因之谜。病因之谜。26三、发热病人血检的质量控制三、发热病人血检的质量控制n 此后，随着显微镜的不断改进和此后，随着显微镜的不断改进和血膜上疟原虫染色方法的出现，使显血膜上疟原虫染色方法的出现，使显微镜检查疟原虫的方法成为疟疾病原微镜检查疟原虫的方法成为疟疾病原学诊断的重要手段。尽管这种方法存学诊断的重要手段。尽管这种方法存在着操作复杂、技术难于掌握等缺点，在着操作复杂、技术难于掌握等缺点，但以其高特异性一