细胞mRNA的提取

1、技术方法名称细胞mRNA的提取基本原理一个典型的哺乳动物细胞含有约10-5 ug总 RNA，其中 80 85%是核糖体 RNA（主要有 28S， 18S，5.8S 和 5S四种）。剩余的 15 20%中大部分由不同的低相对分子量的RNA组成（如转运 RNA和小核 RNA）。这些高丰度的RNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。相反，占RNA总量 1 5%的信使 RNA即 mRNA无论大小还是序列都是相异，其长度从几百碱基到几千碱基不等，其实际含量也随着细胞类型的不同而不同，随细胞生理状态的变化而变化。在单个哺乳动物细胞中，大约有 360

2、,000 个mRNA分子， 12,000 种不同的 mRNA分子。有些 mRNA在mRNA群体中的比例约为3%，而其它一些 mRNA所占的比例则不超过0.01%。这些稀有或低丰度mRNA的拷贝数大约是每个细胞515个。然而，这些低丰度 mRNA有11,000 种，占 mRNA群体的 45%。在真核生物中，大部分 mRNA（组蛋白除外）都是聚腺苷酸化的，其约 200个腺苷酸残基构成的 3尾部为分离真核 mRNA提供了有效的方法。 寡聚（ dT）可以与 poly（ A）尾相结合，被用于回收 mRNA。传统方法是将提取的总 RNA（用酚 - 氯仿抽提细胞裂解液）通过寡聚（ dT）纤维素柱来制备。但为

3、了能将核酸酶造成的损伤降至最低，现在常采用一种更迅速的方法即直接将结合着寡聚（dT）的磁珠加入到细胞裂解液中，再用强磁铁将磁珠吸出再洗出mRNA。某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备 mRNA核-糖体复合物可以作为mRNA提取的替换途径。因为核糖残基在 2和 3位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的 RNA酶 具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。由于RNA酶从裂解的细胞中释放且存在于皮肤上，故要小心防止玻璃器皿、操作平台以及浮尘中RNA酶的污染。目前尚无使RNA酶失活的简易办法。链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新

4、折叠。和大多数DNA酶不同， RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被缓冲液中加入的EDTI或其他金属离子螯合剂失活。防止RNA酶最好的方法就是避免污染。提取细胞 mRNA后，可通过 mRNA翻译、凝胶电泳或 NorthernBlot 分析来检测 mRNA的完整性，通过紫外分光光度计来检测mRNA的纯度。用途及受限因素酶学研究cDNA文库构建RT- PCRS1 核酶分析引物扩增核糖核酸酶保护分子杂交体外转录差异显示基因表达分析mRNA在细胞总 RNA中的比例很低，需要大量的样本用于mRNA的提取，这就大大限制了稀有样本的检测。细胞 mRNA的提取以 Promega公司的 PolyATtract

5、 System 1000为例基本原理任何一种 RNA提取方法都包括以下四个步骤：1）高效裂解细胞或组织；2）变性核蛋白复合物； 3）灭活内源性的 RNase活性； 4）纯化 RNA。所有这些步骤中最重要的是，立即灭活细胞裂解后从膜包围的细胞器中释放出的内源性RNase。用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。PolyATtract? System 1000利用硫氰酸胍（ GTC）和 - 巯基乙醇来灭活细胞抽提液中的核酸酶，利用GTC和 SDS来变性核蛋白复合物。核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来，使得 RNA从溶液中释放出来，并与蛋白质分离。最终 GTC的

6、浓度允许 mRNA的 poly(A) 与合成的生物素化的 Oligo(dT) 探针退火，但仍能完全抑制细胞内的 RNases。短暂的离心完成杂交，并去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。离心后，用?来捕获生物素化的Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles (SA-PMPs)Oligo(dT): mRNA杂交分子。先用高严谨性的条件洗涤磁珠，然后用 Nuclease-Free Water洗脱，便可获得纯化的mRNA 。实验材料实验耗材细胞刮子、微量移液器、量筒、烧杯、盐水瓶、止血钳、锡箔纸、药勺；进口 Tip 、 Tube试剂NaAc 、NaCl、KC

7、l、Na2 HPO4、KH2PO4、无水乙醇、 异丙醇等， 均为分析纯，且最好是新的未开封的；DEPC，焦碳酸二乙酯，购自Invitrogen公司；PolyATtract System 1000， Cat# Z5400 购自 Promega公司。实验前的准备（包括溶液的配制及无RNAase和 DNAase环境的建立）1.无 RNAase和 DNAase环境的建立玻璃制品、铁制品、塑料制品和电泳槽无菌的一次性使用的塑料制品（进口）基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存 RNA。但为了保险起见， 将它们装入无 RNase和 DNase的铁饭盒（干烤： 300， 4h），加 0.1 焦碳

8、酸二乙酯（ DEPC）的水溶液浸泡， 37，至少 2h，或室温下过夜。随后，高压蒸汽灭菌，15 psi （ 1.05 kg/cm 2），15 min。再烘干， 100， 2 3h。实验室用的普通玻璃器皿、铁制品和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于300 干烤 4 h 或更长时间（玻璃器皿、铁制品，若是敞口的器皿，需用锡箔纸封口后再干烤）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用 0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。 灌满 DEPC的玻璃或塑料器皿在37放置小时， 然后用灭菌水淋洗数次，并于 100干烤 15 min 。在 15 lbf/in2(1

9、.034x10 5 Pa)高压蒸气灭菌 15 min 。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防 DEPC通过羧甲基化作用对 RNA的嘌呤碱基进行修饰。用于 RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3的 H2O2 溶液，于室温放置10 min ，然后用 0.1 DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。附 DEPCDEPC是具有高度活性的烷基化试剂，它通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏 RNase的酶活性。虽然 DEPC是 RNase的强烈抑制剂，但是它的作用并不是绝 对的。在水溶液

10、中， DEPC迅速水解为 CO2和乙醇， 在 pH6.0 的磷酸缓冲液中半衰期为 20 min ，在 pH为 7.0 的磷酸缓冲液中为10 min 。这种水解过程通过Tris和其它胺类大大加速，它们自己本身也在这一过程中消耗了。因此，DEPC不能用来处理含有这些缓冲液的溶液。无亲核体（例如：水和乙醇）的DEPC样品是非常稳定的，但是甚至小量的上述溶质也能导致DEPC完全转化成碳酸二乙酯。由于这个原因， DEPC应该防潮，并小份储存于干燥的条件下，在开启瓶子前，应该使瓶子达到足够的温度。溶液的处理用干烤过的药匙称取试剂，用DEPC处理过的无菌去离子水溶解和稀释试剂，将溶液装入无RNase的玻璃器

11、皿。可能的话，溶液均应用 0.1 DEPC于 37至少处理 12 h ，然后于 100加热 15 min 或在 15 lbf/in2(1.034x10 5 Pa) 的高压下蒸气灭菌15 min 。DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。操作者及其操作环境RNase最主要的潜在污染源是操作者和灰尘。操作者应该戴一次性手套，并勤换手套；应该戴口罩和帽子，尽量不要对着RNA样品呼气或说话。灰尘中含有细菌和霉菌，所以应该保持操作环境整洁。对于多次使用的试剂，最好无菌操作。2.溶液的配制无 DNase和 RNa

12、se的去离子水将新鲜制备的去离子水装入干烤过的盐水瓶，加入 DEPC，使其终浓度达到0.1%，振荡混匀后，置于37过夜。高压蒸汽蒸汽灭菌，15 lbf/in2(1.034x10 5 Pa)，15 min 。3M 醋酸钠溶液（ 100 ml）NaAc?3H2O40.81 g新鲜制备的去离子水80 ml搅拌溶解后，用冰乙酸调pH 至 5.2 ，约需 1.85 ml，再加去离子水调至100 ml。加入 100 ul DEPC ，振荡混匀后置于37过夜，然后高压蒸汽灭菌，15lbf/in2(1.034x10 5 Pa)，15 min 。PBS（200 ml）NaCl16 gKCl0.4gNa2 HPO

13、4· 12HO7.26 gKH2PO40.48 g用 160 ml DEPC处理过的无菌去离子水溶解上述试剂，用浓HCl 调 pH至 pH7.4 ，再用 DEPC处理过的无菌去离子水定容至200 ml 。高压蒸汽灭菌，15lbf/in2(1.034x10 5 Pa)，15 min 。70%乙醇采用 DEPC处理过的无菌去离子水配制。无血清培养基 1640实验设计可以根据起始材料的量来确定试剂的用量。对于培养细胞，每次mRNA提取所用的细胞数量上下限分别为108 和 106。对于纯化的mRNA，则分别用紫外分光光度计测定数量和纯度，用凝胶电泳分析完整性。操作步骤及每步需注意的事项按照

14、PolyATtract System 1000的 protocol进行，并作了些修改，具体如下。1.收集细胞清洁工作用干净纱布擦拭桌面；用酒精棉球擦拭桌面、微量移液器、试管架、止血钳、磁架等；预热试剂将试剂盒中的下列组分取出置于桌面上，暖至室温。GTCExtractionBuffer 、BiotinylatedOligo(dT)Probe 、Nuclease-FreeWater 、SSC（0.5 ×）洗涤细胞先用无血清培养基1640 洗涤细胞， 10 ml/T75瓶/ 次，共 3 次。刮细胞每个培养瓶中分别加入6 ml 1640 ，用细胞刮子刮下细胞，注意培养瓶的四个角。镜检判断是否

15、还有残余细胞。将刮下的细胞连同1640 转移至 50 ml离心管。用 1640 洗涤培养瓶，以回收残留在培养瓶中的细胞，尽量减少损失。1640 的用量为： 6 ml/5瓶。然后将液体与上一步合并。洗涤细胞离心，1,500 rpm， 10 min 。去上清，加入预冷的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，并使细胞完全分散。离心，1,500 rpm， 10 mim，去上清，备用。期间，预热Dilution Buffer至 70。2.裂解细胞在一个新的无RNase和DNase污染的50 ml离心管中混和4 ml GTCExtraction Buffer和164 ul - 巯基乙醇。Vortex混匀后加到含细胞沉

16、淀的50 ml 离心管中，高速Vortex 至细胞完全裂解。3.探针退火在一个新的无 Dilution BufferRNase和 DNase污染的 50 ml和 164 ul - 巯基乙醇。离心管中分别加入8 ml 70预热的Vortex 混匀后加到细胞裂解液中，上下颠倒混匀。加入 10 ul Biotinylated Oligo(dT) Probe，混匀后70水浴 5 min 。将裂解液转移至12 个 1.5 ml eppendorf管中，室温下离心， 12,000 rpm，10 min（离心前平衡离心机温度至室温。在室温下离心目的是避免溶液中的盐分和去污剂的析出）。将上清分别转移至12 个

17、新的 1.5 ml eppendorf 管中，室温下离心， 12,000 rpm，10 min 。4.洗涤偶联有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs可以安排在步骤3 中的离心期间进行。轻摇瓶子，使SA-PMPs完全重悬。转移 6 ml SA-PMPs 至一个新的 RNase Free 的 50 ml 离心管中，将离心管置于磁架上，慢慢放平。待磁珠完全聚集到管子一侧时，小心倒掉储存缓冲液。加入 6 ml 0.5× SSC重悬 SA-PMPs，磁架捕获后倒掉上清，具体作法同上一步。重复洗涤步骤2 次，即洗涤 3 次，然后加入6 ml 0.5× SSC重悬 SA-PMPs。5.捕获和洗

18、涤磁珠当步骤 3 完成后，小心转移上清至洗涤过的SA-PMPs中，上下颠倒混匀。注：勿吸沉淀。吸到沉淀会导致整个系统的效能。室温下孵育 10 min 。用磁架捕获 SA-PMPs，将上清转移至一个新的RNase Free 的 50 ml 离心管中，冰浴保存至确认有满意的结果为止。用 1.8 ml （分两次，第一次用 1 ml ，第二次用 0.8 ml） 0.5 × SSC重悬 SA-PMPs并转移至一个2 ml mRNA User Tube 中。用磁架捕获磁珠后，用微量移液器小心地移去上清。重复洗涤 4 次，即共洗涤5 次。最后一次洗涤完成后，尽可能地移去上清，但不扰动 SA-PMP

19、s。注：洗涤时应远离磁架，同时应上下颠倒2 ml mRNAUser Tube以达到充分洗涤SA-PMPs为止。6.洗脱 mRNA加入总量为 1 ml 的 RNase Free Water ，上下颠倒数次后，室温下孵育 3 min 。用磁架捕获 SA-PMPs后，将上清转移至 2 个 1.5 ml eppendorf 管中，每管 0.5 ml，分别编号为 1，2。重复上一步骤一次，eppendorf 管的编号分别为3， 4。往 2 ml mRNA User Tube 中加入 1 ml RNase Free Water，冰浴保存至mRNA产量和纯度的测定完成为止。7.沉淀 mRNA往 1， 2，

20、3， 4 号 eppendorf 管中分别加入50 ul 3 M NaAc和 500 ul异丙醇，上下颠倒混匀后，-20 沉淀过夜。4下离心， 13,000 rpm ， 25 min 。离心完成后，看不到沉淀，但磁珠可指示沉淀的位置。沿着与沉淀面相背的一侧吸出上清。注意勿吸丢沉淀。分别加入1 ml 70% 乙醇。注意：用微量移液器轻轻而又缓慢地将70%乙醇从与沉淀面相背的一侧加入。4下离心， 13,000 rpm ， 25 min 。沿着与沉淀面相背的一侧缓慢地将70%乙醇吸去。注意勿吸丢沉淀。室温下晾干。注意：沉淀不能太干，否则可能难溶解。用 5 ul RNase Free Water 溶解

21、沉淀。溶解沉淀时，用微量移液器反复吸放，以达到充分溶解的目的。8.紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度9.琼脂糖凝胶电泳分析mRNA的完整性10.mRNA的保存短期保存（ <30 d ）：以 0.5-1.0 mg/ml的浓度溶解在水中，并保存于-70 。长期保存（ >30 d ）：将 RNA沉淀保存在 70%乙醇中，置于 -70 。结果观察及分析的原则1）紫外分光光度计测定mRNA的数量和纯度280、 320、 230、 260nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。对于纯净的样品，A 320 一般是 0， A 260 / A 230的比值大于 2.0。若 A 260 / A 230 小于 2，则表明样品中仍存在 GTC 或 -巯基乙醇。对于A260 / A 280（ Ratio， R），当 R>1.82 时，说明 RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris 作为缓冲液检测吸光度时， R值可能会大于 2（一般应该是 <2.2 的）。当 R<1.8 时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA （不同的实验对 RNA 质量的要求不同）。当R>2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。测定mRNA的纯度时，应采