褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制

1、褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制         08-01-12 15:40:00     作者：李夏春，张军霞    编辑：studa20【关键词】  阿尔茨海默病  摘要：目的  探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制。方法  采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2awt)，给予CA处理，或同时给予不同浓度Mel或

2、维生素E(Vit E)处理，并用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水平和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)含量，32P特异底物标记技术检测PP2A活性。结果  CA可在N2awt细胞引起神经细丝过度磷酸化，同时伴有PP2A含量和活性降低。Mel对CA引起的神经细丝过度磷酸化有保护作用，且强于Vit E；Mel同时对抗CA诱导的PP2A活性和含量降低。结论  Mel可通过调节细胞内PP2A的含量和活性而减轻CA引起的神经细丝过度磷酸化。关键词：阿尔茨海默病；花萼海绵诱癌素；褪黑素；神经细丝；过度磷酸化ABSTRACT: Objective  To investigate the

3、 in vivo effect of melatonin on calyculin Ainduced neurofilament (NF) hyperphosphorylation in neuroblastma cells (N2awt). Methods  N2awt cells were treated with CA or CA and different concentration melatonin or CA and vitamin E, the levels of neurofilament phosphorylation and the level of PP2A

4、were detected, and the activities of PP2A were assayed. Results  Calyculin A treatment led to neurofilament hyperphosphorylation by decreasing the level and activity of PP2A. Both melatonin and vitamin E had protective effect on calyculin Ainduced neurofilament hyperphosphorylation, although me

5、latonin increased the activity of PP2A while vitamin E did not. Morever, melatonin partially attenuated the decreasing of PP2A level. Conclusion  Melatonin protects neuroblastma cells from CAinduced neurofilament hyperphosphorylation through the regulation of PP2A level and the increase of PP2A

6、 activity.KEY WORDS: Alzheimers disease; calyculin A; melatonin; neurofilament; hyperphosphorylation阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床症状的神经退行性疾病，神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs) 是其主要病理特征之一。NFTs主要由异常过度磷酸化的tau蛋白构成，tau蛋白作为细胞内的主要骨架蛋白，对微管组装、维持微管稳定性都具有重要作用。神经细丝(neurofilament，NF)是

7、骨架蛋白中的中间丝，由低(NFL)、中(NFM)、高(NFH)分子量的三种亚基组成，它与微管、微管相关蛋白(包括tau蛋白在内)等其他骨架蛋白存在广泛的相互作用，并共同维持着细胞骨架的正常结构。Nancy 等证实异常过度磷酸化的神经细丝也是NFTs的重要组成成分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到重视。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果体分泌的一种具有多种生物学功能的内分泌激素，随着年龄的增长其分泌量逐渐下降。研究发现AD患者脑脊液中Mel的水平显著低于同年龄正常人群，临床上AD患者给予Mel后，可以改善某些患者的认知功能。因此，Mel分泌紊乱在AD的发病过程中可能起重要作用。最

8、近有人报道，Mel可阻断或逆转冈田酸(okadaic acid, OA)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管破坏。我们曾报道Mel可对抗花萼海绵诱癌素(calyculin A, CA)在SY5Y细胞引起的神经细丝过度磷酸化。为进一步研究Mel对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化的机制，我们分别用Mel和维生素E(vitamin E, Vit E)与CA同时处理成神经瘤细胞N2awt，用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水平和PP2A含量，免疫标记技术检测PP2A活性。结果发现Mel和Vit E可对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化，同时Mel对抗CA引起的PP2A活性降低和含量降低。本

9、实验进一步揭示了Mel和Vit E对抗CA诱导的神经细丝磷酸化的机制。1  材料与方法1.1  主要试剂  DMEM、OptiMEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibico公司；丙烯酰胺(Arc)、N，N亚甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(Glycine)、小牛血清白蛋白(BSA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、Mel、Vit E均为美国Sigma公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Hybond公司产品；单克隆抗体SMI31(识别磷酸

10、化的NFH、NFM，15000)、SMI32(识别非磷酸化的NFH、NFM，15000)、R123d(识别PP2A的催化亚单位，11500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标记的二抗和ECL显色系统购自Santa Cruz公司；CA购自美国Biochemical公司；32PATP购自北京亚辉生物医药公司。1.2  细胞培养  鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2awt)由许华熙教授(The Burnham Institute, La Jolla, California, USA)提供，细胞用含50g/L胎

11、牛血清(FBS)的DMEM/OptiMEM(11)培养基，在5%(体积分数)CO2、37培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达约70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为6组：正常对照组，加入含DMSO(<0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/L CA；25mol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入25mol/L Mel；50mol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入50mol/L Mel；100mol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入100mol/L Mel；Vit

12、E组，加入5nmol/L CA同时加入50mol/L Vit E。1.3  蛋白质印迹分析  按上述分组加药处理细胞12h后，弃培养基，预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液90L(50mmol/L TrisCl pH8.0，150mmol/L NaCl, 10mL/L Triton，1g/L SDS，0.2g/L NaN3，100mg/L PMSF，1mg/L aprotinin，PMSF和aprotinin临用前加入)，在冰上静置10min，用细胞刮刮起细胞并转移到EP管中，加入4×加样缓冲液30L，煮沸10min，超声破碎(3×5s)，12000g离心

13、10min，取上清。取样品加入各个泳道(保证各泳道加入的样品蛋白总量为10g)，蛋白质经7.5% SDSPAGE凝胶电泳分离后被转移至NC膜上；NC膜用50g/L脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入单克隆抗体SMI31、SMI32，R123d，4孵育过夜，然后用含1g/LTween20的 TBS(TTBS)漂洗(3×5min)；再加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37孵育1h，TTBS漂洗(3×5min)；加入ECL显色液，显色1min，终止显色并将胶片置于NC膜上，在暗室里曝光30s，免疫印迹结果扫描后用图象分析系统分析。1.4  PP2A活性测定 

14、按照Gong等的方法。在磷酸化缓冲液(单位：mmol/L，TrisHCl 40、pH 8.5, ME 20，CaCl2 0.2，MgCl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5mmol/L 32PATP 及10mg/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30孵育10min后，Phb被磷酸化为Pha并有一部分被32P标记；32P标记的磷酸化酶a(32PPha)经Sephadex G50柱与游离ATP(Free32P)分离，收集组分中32P Pha的放射性/(Free32P的放射性+32P Pha的放射性)×100%>95%作为PP2A的底物。PP2A 催化32PPha释放出32P，根据32P的释放量可判定PP2A的活性。反应体系总体积20L， 含Tris 50mmol/L、pH 7.0，BME 10mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，caffeine 7.5mmol/L，7.5mg/L 32PPha和0.06g/L细胞提取物及0.2g/L抑制因子1(PP1的特异性抑制剂)，反应以加