体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究

1、体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究         08-01-15 10:24:00     作者：刘文佳周洪王晓荣    编辑：studa20【摘要】  目的 建立人破骨样细胞体外培养的方法，探讨1,25(OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等骨吸收刺激因子对破骨细胞分化、增殖和功能的影响，为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础。方法 将脐血单核细胞接种于预置盖玻片和骨片

2、的24孔培养板中，实验组分别加入诱导因子1，25(OH)2D3、MCSF、PGE2，对照组不加，每3d换液一次，培养7d。采用倒置相差显微镜、TRAP染色等方法观察破骨样细胞的形成情况。结果 第3天实验组单核细胞出现融合趋势，第7天TRAP染色可见阳性的多核破骨样细胞，但尚未形成骨吸收陷窝，以1,25(OH)2D3组破骨样细胞形成数量最多。结论 脐血单核细胞经1,25(OH)2D3、MCSF、PGE2体外诱导培养后可分化为TRAP(+)多核的破骨样细胞，且10-8mol/L的1，25(OH)2D3具有最强的生物学效应。 【关键词】  脐血单核细胞；破骨样细胞；细胞培养；1,25(OH

3、)2D3；MCSF；PGE2Differentiation of osteoclastlike cells inducedfrom umbilical cord blood cells in vitroABSTRACT: Objective  To establish a stable and useful method for culturing human osteoclastlike cells in vitro, and investigate the effect of 1, 25(OH)2D3, MCSF and PGE2 on osteoclasts different

4、iation, proliferation and activation so as to lay the foundation for further study of the biological mechanism for tooth movement. Methods  The HCMNC were isolated and cultured in 24well plate with coverslips and human dentine slices. The experiment group was cultured with 1, 25(OH)2D3, MCSF an

5、d PGE2, respectively, while the control group was not. The liquid was changed every 3 days and the whole culture process lasted for 7 days. The phase contrast microscopy and TRAP staining were adopted to identify osteoclastlike cells. Results  On the 3rd day the monocytes began to fuse and on t

6、he 7th day positive multinucleated cells could be seen with TRAP staining, but absorption pit was not formed on the dentin slices. The group with 1, 25(OH)2D3 had the largest number of osteoclastlike cells. Conclusion  After the monocytes in UCB are cultured by 1, 25(OH)2D3, MCSF, PGE2 inductio

7、n, they can turn into TRAP(+) multinucleate osteoclastlike cells, the 1, 25(OH)2D3 10- 8mol/L being the most effective.KEY WORDS: mononucleated cell of umbilical cord blood; osteoclast; cell culture; 1, 25(OH)2D3; MCSF; PGE2破骨细胞(osteoclast cells, OC)是具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，OC由单核细胞(mononucleated ce

8、lls, MNC)融合而成，不能增殖和传代。破骨样细胞(osteoclastlike cells, OLC)是指实验中原代培养或诱导生成的，具有OC性质，用于细胞学或分子生物学研究的细胞。OLC与OC的不同是前者用于实验研究，而后者位于骨改建部位。体外培养OC，在MNC融合的过程中，受到多种细胞因子以及产生这些细胞因子的细胞及其相关刺激的影响，研究表明：1,25(OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等是OC分化发育的关键因子，可支持血缘性MNC向OC分化。Fujikawa 等1证明在人外周血中存在破骨细胞前体细胞，而人脐血中含丰富的更原始的血缘性前体细胞，特

9、别是粒单核系祖细胞(CFUGM)或CFU混合多核细胞集落含量高2。因此，本实验通过对脐血单核细胞(HCMNC)的体外诱导培养，观察1，25(OH) 2D3、MCSF以及PGE2对人OLC形成的影响。1  材料与方法1.1  材料1.1.1  实验对象  非高危妊娠的健康孕妇，于胎儿娩出后、胎盘未完全娩出前自脐静脉穿刺，无菌条件下收集脐带血(UCB)，肝素抗凝。1.1.2  主要试剂  MEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(浙江金华生物制剂公司)，人淋巴细胞分离液(天津灏洋公司)，1,25(OH)2D3(Sigma公司)，重组人MC

10、SF (Sigma公司)，PGE2(Sigma 公司) ，萘酚ASBI磷酸盐(Sigma公司)。1.2  方法1.2.1  玻片及骨磨片的处理  将1.0cm×1.0cm盖玻片超声清洗后浸入硫酸重铬酸钾溶液中过夜，高压灭菌后备用。取新鲜牛股骨，制备成0.5cm×0.5cm厚100-200m的骨片，超声清洗10min×3次，浸入10倍双抗中20min×3次，紫外线照射消毒后存放于-20备用。1.2.2  分离HCMNC  取健康产妇抗凝UCB 50mL，与PBS等体积混合；将稀释血液以体积比11沿管壁轻轻加

11、于Ficoll液面上，使二者形成一个清晰的界面；2000r/min离心20min，吸取呈云雾状的白膜层(主要含单个核细胞)，收集于离心管内；用PBS洗3次，1000r/min离心5min，弃上清，加入含15%(体积分数)FBS的MEM培养液重悬计数，调整细胞浓度为1×106/mL。1.2.3  实验分组和诱导培养HCMNC  将收集的HCMNC接种于预置盖玻片和骨片的24孔培养板中，每孔加入HCMNC悬液1.0mL，在37，5%(体积分数)CO2孵育箱内培养2h，全量换液后分组加入诱导培养液，实验分5组：A组为空白对照，不加任何诱导因子；B组加入1，25(OH)2

12、D3 1×10-8mol/L；C组加入1，25(OH)2D3 1×10-7mol/L；D组加入MCSF 20×10-6g/L；E组加入1，25(OH)2D3 1×10-8mol/L和PGE21×10-6mol/L。每3d全量换液1次，培养7d。1.2.4  细胞形态学观察  用倒置显微镜观察贴壁生长的细胞形态，融合现象以及多核细胞形成的情况。1.2.5  TRAP染色  取培养第7天的细胞爬片，用2.5%(体积分数)戊二醛固定液4固定10-15min，蒸馏水洗3次；浸入TRAP染色孵育液37，50min，双蒸水洗3次；细胞爬片的面向下，中性树胶封片，光镜观察。1.2.6  骨吸收陷窝观察  取培养第7天的骨片经2.5%(体积分数)戊二醛固定液固定7min，0.25mol/L氢氧化铵超声清洗1min×3次，系列酒精脱水，自然晾干，1%(体积分数)甲苯胺蓝染液室温染色4min，蒸馏水洗后光镜下观察。1.2.7  OLC及骨吸