中、重症呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的实验探究

1、中、重症呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的实验探究    【摘要】  目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染的中、重症小鼠模型。方法 36只小鼠分为实验组（16只）、实验组（16只）和正常对照组（4只）。采用RSV原液（TCID50为10-4.2/100 l）及100TCID50RSV液分别滴鼻感染实验、组BALB/c小鼠，于感染后第3、5、7、9 d处死小鼠，进行病毒分离，病理光镜和电镜检查。结果 实验组的病毒分离阳性率明显高于实验组，二者相比有显著性差异（P<0.01）；光镜下实验组肺泡壁明显增厚，毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，以

2、级炎症为主；实验组病变较实验组轻，级炎症面积及炎性细胞浸润支气管百分数少于实验组，两组间有显著差异（P<0.05）。2组病变以第5 d最重，第7 d后开始减轻。电镜下实验组可见肺泡型、型上皮细胞及毛细血管内皮细胞肿胀，肺泡隔水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；实验组病变轻于实验组。结论 用RSV原液可以成功地建立中、重症RSV感染的动物模型。 【关键词】  呼吸道合胞病毒；模型   Experimental Study on Mouse Model of Moderate and Severe     Respiratory Sy

3、ncytial Virus Infection     LI Yanhui     Department of Child Health, Xian No. 4 Hospital, Xian, 710004     【Abstract】Objective  To establish the mouse model of moderate and severe respiratory syncytial virus infection.Methods  BALB/c mouse were

4、 infected by RSV stock solution (TCID50, 10-4.2/100l) and 100TCID50RSV dropping in nasal cavity. On 3, 5, 7 and 9 days post infection, the mouse were killed, then viral isolation, light and electron microscope examination were performed respectively.Results  The positive rate of viral isolation

5、 in the RSV stock solution group (experimental group I) was obviously higher than that in the 100TCID50RSV group (experimental group II) with significant statistics difference between them (P0.01). Under light microscope, alveolar wall thickened significantly and capillary engorged with more lymphoc

6、ytic infiltration in experimental group I, and the third grade inflammation was dominating. While in experimental group II, response was more palliative than that in experimental group I. And the area of the third grade inflammation and the percentage of inflammatory cell infiltrate bronchus were le

7、ss than in experimental group I with significant statistics difference (P0.05). Affection was the most serious in the fifth day and it began to relieve after the seventh day. Under electron microscope, type I, II alveolar epithelial cell and capillary endothelium cell were swelling, interalveolar se

8、ptum was edema and lymphocytic, monocyte and eosinophile granulocyte infiltration were seen in experimental group I. Affection in experimental group II was more palliative than that in experimental group I.Conclusion  Mouse model of moderate and severe RS virus infection can be constructed succ

9、essfully by RSV stock solution.     【Key words】respiratory syncytial virus (RSV); animal model      呼吸道合胞病毒（RSV）是2岁以下婴幼儿毛细支气管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，病情严重者可发生呼吸衰竭，甚至死亡。但是到目前为止，尚无用于RSV感染的特效药，而且其发病机制尚不清楚，因此亟须建立一个中、重症RSV感染动物模型，以研究 RSV感染导致的疾病。本实验采用不同浓度的RSV液感染小鼠，以期获得一个中、重症RSV感染模型

10、。     1  材料和方法     1.1  材料  RSVLong株及人喉癌上皮细胞系（Hep-2细胞），购自北京儿科研究所。清洁级近交系BALB/c雌性小鼠36只，68周龄，体重20±2 g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。     1.2  方法     1.2.1  病毒毒力滴定  将RSV-Long株滴入生长状态良好的单层Hep-2细胞（细胞浓度1×105）中，发生细胞病变后连传

11、3代，在细胞融合病变最明显时，用力振荡细胞瓶，使细胞从瓶壁脱落，反复冻融3次，4离心，去除细胞散片，取上清液，采用Reed-Muench微量法滴定病毒效价，-30°C保存，用于动物接种。     1.2.2  动物模型的建立 36只小鼠分为3组：实验组、实验组每组16只，正常对照组4只。用乙醚完全麻醉后，实验组经鼻缓慢滴入RSV原液（TCID50为10-4.2/100 l），实验组经鼻缓慢滴入100TCID50RSV液，每侧鼻孔各0.1 ml；对照组每侧鼻孔给予0.1 ml的1640维持液。     1.2.3&#

12、160; 标本的采集  于感染后第3、5、7、9 d处死小鼠。无菌条件下取出肺组织，左肺一部分用10中性福尔马林固定，石蜡包埋制成切片，作HE染色观察肺组织病理改变，另一部分用4戊二醛固定，用于透射电子显微镜下观察肺组织超微结构的改变；右肺置于灭菌Hanks液中，用于病毒分离。     1.2.4  肺组织病毒分离  无菌条件下取出的肺组织称重后用hanks液洗2次，按10 ml/g加入Eagle液，剪碎新鲜的肺组织标本，研磨后离心5 min，收集上清，接种到Hep-2细胞中，观察细胞病变，待细胞融合病变“+”时，记录结果。 

13、0;   1.2.5  光镜标本结果判定及统计学处理  做肺横切面连续切片，每隔100 取切片1张，共取3张。置网格目镜测微尺在400倍镜下，每张切片取10个视野，计数切片上肺泡炎0级方格数及每张切片内全部支气管数和炎性细胞浸润的支气管数，数据取3张切片的均数。     参照Szapiel1提供的肺泡炎分级， 0级病变确定如下：0级为无肺泡炎；级为肺泡壁间质水肿，毛细血管充血致肺泡壁轻度增厚；级为肺泡壁中度增厚，肺泡腔变小；级为肺泡壁重度增厚，肺泡腔狭小或膨大；级为肺实变。     计数资料用率

14、表示，组间比较采用方差分析。     2  结果     2.1  病毒效价：在96孔板中滴定病毒效价为104TCID50。     2.2  肺组织病毒分离：实验、组第5 d病毒分离阳性率分别为83.3、66.8，第7 d分别为62.5、40.5，第5、7 d实验、组病毒分离阳性率相比分别有显著差异（P<0.01）。     2.3 1 2 下一页     病理检查结果

15、     2.3.1  实验组  光镜下肺泡出现典型的间质性肺炎表现，肺泡壁明显增厚，毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，肺泡腔明显狭窄（见封四图1），病变以感染后第5 d最显著，此时级炎症占绝大多数，炎性细胞浸润支气管数接近全部，第7 d炎症开始减轻，第9 d炎症明显好转，以、级炎症为主，炎性细胞浸润支气管数明显减少，与实验组相比有显著差异（P<0.05）。见表1。     电镜下可见肺泡型上皮细胞肿胀（见封四图2），形成水泡样，并坏死或脱落；肺泡隔有水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；毛细血管

16、内皮细胞肿胀，形成大小不等的囊泡，有的形成窗隔样裂隙，在病变严重的肺泡腔内，可见富含蛋白的渗液，各种炎症细胞和红细胞；肺泡型上皮细胞肿胀。     2.3.2  实验组  表现为间质性肺炎，病变过程与实验组相似，但病变程度有所减轻，光镜下病理改变及电镜下超微结构的病变亦轻于实验组。见表1。     3  讨论     用RSV滴鼻能感染多种动物，如纯系小鼠、大鼠、棉鼠、豚鼠、雪貂和黑猩猩等。而BALB/c小鼠，由于其确定的基因，易于处理等优点，适用于免疫学、疫苗的研制等方面，

17、被认为是研究RSV感染的最常用的动物模型2，人类RSV毒株经鼻滴入BALB/c小鼠后，很容易感染小鼠肺组织，而且其感染的时间进程、病理表现与人体非常相似3。表1  两实验组各级肺炎面积构成比及炎性细胞浸润支气管百分数比较     建立RSV感染动物模型，要求病毒对照组有尽可能高的发病率，并且建立的模型其肺组织病变程度与正常相比要有一定的下降空间，因此筛选适当的接种病毒浓度十分重要。目前常用的造模浓度多为100TCID50RSV液，但是临床中的RSV感染轻重不一，严重者引起呼吸衰竭，甚至死亡等严重后果，因此建立中、重症的RSV感染模型有较大的临床意义。本研

18、究采用RSV原液（TCID50为10-4.2/100 l）及100TCID50RSV液建立模型，结果显示2组小鼠肺组织均可分离出RSV病毒，但实验组（RSV原液组）的病毒分离率明显高于实验组（100TCID50组），而且实验组的肺组织病变程度重于实验组，因此用RSV原液更适合于建立中、重症RSV感染模型。本研究显示RSV感染后3 d内病毒仅存在于上呼吸道，尚未侵及肺组织，第5 d肺组织病变最重，此时病毒复制处于高峰期，感染9 d后病变明显减轻，与以往的研究相似4。     综上所述，用RSV原液可以成功地建立中、重症RSV感染的动物模型，可以用于RSV感染的发病机制及治疗的研究。 【参考文献】  1 Szapiel S V, Elson N A, Fulmer T D, et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouseJ. Am Rev Respir Dis,1979,120(4): 893. 2 Xiaoyuan Kong, Gary R Hellermann, Geoff Patton, et al. An immunocompromised BALB/c mouse model for re