鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

1、鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体         08-07-04 16:27:00     编辑：studa20           作者  黄仕龙陈安民郭风劲张衣北【关键词】  殖区软骨细胞,    摘要：目的分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞，克隆甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrp）基因并构

2、建真核表达载体pEGFPIRES2PTHrp。方法Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞，用X型胶原抗体和电镜鉴定，提取总RNA，RTPCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA，插入pCR21 TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFPIRES2。结果分离出增殖区软骨细胞，经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体，为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。关键词：PTHrp基因；质粒；殖区软骨细胞；表达载体

3、Identification of epiphyseal proliferating zone cells and construction of eukaryotic expression vector containing PTHrp geneAbstract：ObjectiveTo separates proliferating zone cells from the growth plate,then clone the parathroid hormonerelated peptide gene (PTHrp) and construct its eukaryotic express

4、ion vectorMethodAfter centrifugation through a discontinuous Percoll gradient,the third and fourth fractions cell populations of growth plate chondrocytes were identified with anticollagen type X and electron microscope imageThe total RNA was extracted from cells after identification and the full le

5、ngth eDNA encoding PTHrp gene was obtained by RTPCR method and inserted into pCR21 TA cloning vectorAfter the sequencing was confirmed,the gene was subcloned to pEGFPIRES2 to construct recombinant eukaryotic expression vector pEGFPIRES2PTHrpResultThe proliferating zone cells were separated from grow

6、th plateEnzyme digestion analysis and sequencing showed that the target gene was cloned into recombinant vectorConclusionThe proliferating zone cells were identified accurately and the eukaryotic expression plasmid containing PTHrp gene was successfully constructed,which may be a promising for study

7、ing the biological function of the PTHrp gene and its role in chondrocyte differentiation and bone formationKey words：PTHrp gene; Plasmid;Growth chondrocyte;  Expression vector                    

8、;                                 软骨缺损临床极为常见。软骨受损后自我修复能力极为有限，且对软骨细胞的增殖、分化规律和调控机理缺乏认识，目前对软骨缺损尚无很好的治疗方法。甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)在研究恶性肿瘤高钙血症时被发现，故称为体液

9、恶性肿瘤高钙血症因子(HHM)，因与PTH生物学特性相似，现在称为PTHrp其基因定位于12号染色体短臂。近年来，对PTHrp的功能研究取得了初步进展，但其确切的生物学作用仍不清楚。PTHrp分布较广，在骨骺增殖区细胞中丰度最高。有研究发现PTHrp主要通过自分泌和旁分泌发挥作用，最近研究表明PTHrp是一种重要的发育调节分子，可能通过Ihh信号途径抑制软骨细胞的分化和成熟并刺激其增殖，以延长软骨发育成熟过程，延迟软骨发育，抑制软骨细胞凋亡，从而有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构。由此可见，深入研究PTHrp基因的功能对于阐明软骨骺板分化发育机理以及调节软骨生长都有重要意义。本研究从

10、骨骺增殖区软骨细胞中克隆得到了PTHrp基因，成功构建了真核表达载体，为下一步揭示PTHrp的生物学功能以及其在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定基础。1  材料和方法11 主要材料纯系清洁级SD大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。111  主要试剂和工具酶载体pEGFPIRES2购自美国lnvitrogen公司，载体pCR21 TA、菌种Ecoli DH5由同济医院矫形外科实验室保存，DMEMF12培养基购自Hyclone公司，胎牛血清、青链霉素、collagenaseP、DNA酶I购自Gibco公司，DNALadder、TrizolReagent、Bam

11、HI、EcoRl、TaqDNA合成酶，购自MBI Fermentas公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，兔抗鼠anticollagentype X购自Calbiochem公司，PCR clean up kit、NDA Extraction Kit、Plasmid lsolation Kit购自上海华舜公司，SP9000免疫组化试剂盒、ZLI9032浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司。112 引物设计根据GeneBank(NM012636)序列编码区自行设计上下游引物，由上海生工工程公司合成，上游序列为：5CG GAA TTC TGG AGG CGC TGA TTC CTA CA3

12、，下游序列为：5CG GGA TCC AAC GTG TCC TTG GAA GAT CT3。12  方法121  骨骺生长板增殖区软骨细胞的取材参考靳小兵1，Barbara DBoyan等2的方法并做适当改良。无菌分离新生SD大鼠股骨和胫骨，去除软组织，锐性分离骨骺与骨干之间膨大、半透明组织置DMEMF12培养基中，充分剪碎37 孵育过夜。根据Ju¨rgen Weisser等4方法，组织碎片以01胰蛋白酶(HBSS配制)37 温和振荡孵育20 min，DMEMF12洗涤，001胶原酶P 37 温和振荡消化过夜，继以01胶原酶P 37 处理4 h以充分释放细胞。4

13、0目筛网过滤、洗涤后以含001DNA酶I的培养基重悬细胞，小心移至预先配置的不连续percoll密度梯度液顶层，400 g离心1 h，取第4层细胞(密度约为1053 gml)观察(图1)、计数后接种于含10FBS、50 gml VitC 的DMEMF12培养基中，5CO2，100湿度，37 培养24 h后换液，以后每72h换液1次，细胞融合至7580传代。取传第4代细胞鉴定(图2)3。122 增殖区软骨细胞的鉴定取第4代细胞，以104ml的密度接种于24孔板，培养35 d，细胞爬片后按SP试剂盒的方法固定、漂洗、破膜，anticollagen type X孵育，DAB显色，常规脱水、透明、封片

14、后观察(图3)。取生长良好的第4代细胞，常规方法制备透射电镜标本(图4)。123 PTHrp基因的克隆取第4代软骨细胞约106数量级，按Trizol Reagent Kit说明书操作，一步法提取增殖区软骨细胞总RNA，测浓度后取约2 g总RNA作为逆转录模板，根据Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第1链，常规50 l PCR反应体系扩增PTHrp基因开放阅读区片断，模板用量1 l。PCR反应条件为：95 预变性5 min，94 变性1 min；62 退火45 s；72 延伸45 s；经30个循环，72 延伸10 min。取5 l反应产物，以12琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定扩增产物。