荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方法比较观察

1、荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方法比较观察【摘要】目的：探讨荧光原位杂交技术检测端粒酶基因(hTERC)实验方法的最佳方案。方法：采集海医附院收治的140例患者的宫颈脱落细胞,分别应用液基取材刷、无菌棉签取材法;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种制片方法;水浴和直接消化法;甲酰胺法和共变性法,通过检测宫颈脱落细胞hTERC基因表达成功率,对比实验方法的最佳方案。结果：取材方法中液基取材刷与无菌棉签的细胞数量满意率分别为95.5%、14.3%，2种方法差异有统计学意义(P0.05) ;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种方法杂交成功率

2、分别是80.0%、84.8%、46.2%、82.1%,其中直接取液滴片与其他法差异有统计学意义 (P0.05);2种消化法中水浴和直接法杂交成功率分别为88.9%、94.1%，差异无统计学意义(P0.05)，杂信号比例分别为16.7%、45.6%，差异有统计学意义(P0.05);2种变性法中甲酰胺法和共变性法杂交成功率分别为72.3%、96.0%，差异有统计学意义(P0.05)。结论：荧光原位杂交技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时,以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法和共变性杂交成功率最高。 【关键词】 荧光原位杂交;宫颈脱落细胞;TERC基因 Experiment

3、al comparison of fluorescence in situ hybridization in cervical exfoliated cell hTERC gene detectionZENG Rongrong1,2, JIN Song1(1 Department of Gynaecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Hainan Medical College Haikou 571101, China;2 Guiyang Traditional Chinese Medical College Guiyang 550002,

4、 China)ABSTRACT Objective: To investigate the optimal methods of fluorescence in situ hybridization on hTERC gene detection. Methods： 140 samples of cervical exfoliated cells were gathered by fluidbase brush sampling and aseptic cotton sampling in the Affiliated Hospital of Hainan Medical College; m

5、ovies were made by physiological saline infiltration, TCT infiltration, direct dropping and direct TCT infiltration. All experimental methods, bath and direct digestion, formamide and denaturation law, were compared by detecting the success expression of cervix castoff cells hTERC gene. Results： In

6、sampling methods, the satisfactory rate of cell quantity in fluidbase brush and aseptic cotton were 95.5% and 14.3%( P0.05); In hybridization technique, the success rate of 4 methods were 80.0%,84.8%,46.2%,82.1%, respectively, compared to direct dropping method, other three methods were preferable (

7、P0.05). But hybridization signal ratio were 16.7% and 45.6%， with significant difference(P0.05). In two denaturation methods, the success rate were 72.3% and 96.0%，with significant difference(P0.05). Conclusion： Detecting hTERC gene by fluorescence in situ hybridization, fluidbase brush is better sa

8、mpling of quantity cells, TCT infiltration is preferable in making movies, bath and hybridization variability have higher success rate.KEY WORDS Fluorescence in situ hybridization; Cervical exfoliated cells; TERC gene随着分子生物学的发展，人们运用荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测宫颈脱落细胞中3号染色体长臂2

9、6. 3位点端粒酶基因( human telomerase RNA component,hTERC)的扩增,发现它与宫颈病变有着密切的关系1。FISH的原理是以已知的标记单链核酸为探针,按碱基互补原则,与待检材料中未知单链核酸进行结合,形成荧光显微镜下可检测的荧光信号,本实验从取材、制片、消化、变性4个方面,探讨实验方法对FISH杂交率的影响。1 材料与方法1. 1 材料来源收集2007年11月2009年3月在海南医学院临床附属医院就诊的140例妇科患者的宫颈脱落细胞标本(排除严重内科疾病及生殖系统炎症)。1. 2 方法FISH检测均以细胞学检查和组织病理学结果为参照标准。1. 2. 1 取材

10、 (1)液基取材刷：患者取膀胱结石位，暴露宫颈，干棉签擦拭分泌物，使用一次性TCT毛刷插入宫颈口,在宫颈外口鳞柱状上皮交界处,以宫颈外口为中心,均匀按顺(逆)时针旋转5周,停留10 s左右，将宫颈刷置于TCT液基中保存;(2)无菌棉签：取材方法同前，棉签放于生理盐水中保存。1. 2. 2 制片 (1)生理盐水低渗：将生理盐水细胞储存液充分震荡10 min，放置12 min后取10 mL细胞储存液 , 1 500 r/min 离心10 min, 去上清，如细胞少，可再取更多液体。加5 mL胶原酶B, 37水浴30 min,间断吹打，离心,加5mL去离子水37水浴20 min,加入2mL固定液(冰

11、乙酸甲醇=13)固定10 min,离心后弃上清,吹打悬浮细胞,重复2次固定，取适量密度细胞悬液10 L用移液器滴片。(2)TCT低渗：胶原酶B 20 min，去离子水40 min，其余处理同生理盐水法。(3)直接取液滴片：取10 mL细胞储存液 , 1 500 r/min 离心10 min, 去上清，滴片同前，滴片后用95%乙醇固定10 min。(4)TCT直接低渗：不加胶原酶B ，余同TCT低渗。4种方法制片后均自然干燥，室温下过夜老化。1.3 判断标准1. 4 统计学处理采用2 检验,检验标准 = 0. 05。2 结果 2. 1 取材方法133例液基取材刷与7例无菌棉签的细胞数量满意率分别

12、为95.5%(127/133)、14.3%(1/7)，2种方法差异有统计学意义( P0.05) 。2.2 制片方法25例生理盐水低渗、46例TCT低渗、13例直接取液滴片、56例TCT直接低渗制片细胞数满意率分别为68.0%、65.2%、92.3%、75.0%，直接取液滴片组与其他组对比差异有统计学意义( P0.05)，其次为TCT直接低渗法较好;各组之间细胞分散度满意率分别为80.0%、84.8%、38.5%、64.3%，差异有统计学意义(P0.05)，TCT低渗最好,直接取液滴片最低;各组之间玻片背景清晰满意率分别为60.0%、76.1%、38.5%、62.5%，直接取液滴片组与其他组对比

13、差异有统计学意义(P0.05)，以TCT低渗法最好，直接取液滴片组最低;杂交成功率分别为80.0%、84.8%、46.2%、82.1%，直接取液滴片组与其他组对比差异有统计学意义(P0.05);杂信号比例分别为16.7%、45.6%，差异有统计学意义(P0.05)。2.4 变性方法65例甲酰胺法和75例共变性法杂交成功率分别为72.3%(47/65)、96.0%(72/75)，差异有统计学意义(P0.05)。3 讨论现代细胞遗传学和分子生物学研究表明，大多数实体肿瘤细胞，常表现为染色体不稳定性，即染色体数目的改变和染色体结构异常。对宫颈癌染色体不稳定的研究显示，常见染色体3q增加和2，3，4，

14、6p，11q的缺失，并且异常基因区多位于3q26.1-q28，其中涉及到的最重要的基因可能是人类染色体端粒酶(hTERC基因图位于3q26.3)基因。研究发现,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。有学者采用FISH技术检测液基细胞学样本,发现3q26.3扩增比例在宫颈高度病变与鳞癌中占较高百分率,而在正常宫颈与非典型鳞状上皮细胞中不出现显著扩增13。因此，对hTERC基因扩增的检测有助于宫颈癌的筛查及早期诊断，而检测基因扩增的标准方法即为FISH46。采用荧光标记的探针，与被检测样本中的DNA杂交后，在荧光显微镜下检测荧光信号而得出结果。FISH具有较好

15、的灵敏性及特异性，并且不需要细胞培养，可以用于间期细胞。本实验从取材、制片、消化、变性几个方面探讨实验方法对FISH检测的影响。从取材方法来看，无菌棉签与液基取材刷相比，无菌棉签采集脱落细胞数量明显少于取材刷法，原因在于细胞黏附在棉签上，震荡后仍有大部分细胞吸附其上。从制片方法来看，TCT低渗法较生理盐水、TCT直接低渗法和直接涂片法在细胞分散度、细胞核形态、背景情况上效果好，但细胞数量要低。直接涂片法细胞数量多，但细胞分布不均，黏液、杂质多。生理盐水法细胞形态保持较好，但黏液对杂交有一定的影响，而且炎症细胞和血细胞也在一定程度上干扰信号的判读。TCT直接低渗法与TCT低渗法差异为不加用胶原酶

16、B，结果显示在细胞分散度、背景、杂信号方面不如TCT低渗法满意。出现以上现象的原因可能在于：(1)通过胶原酶、低渗、反复离心去上清、吹打使细胞数量受到一定损失;(2)TCT液基成分对细胞悬液中黏液、炎症细胞、红细胞、杂质的处理有一定的帮助;(3)胶原酶、低渗的运用可进一步消化黏液和膨胀、疏松细胞核，为杂交做好准备。从消化方法来看，直接法较水浴杂交率稍高，但非特异性信号较多，对结果判读有一定影响，需加强洗涤以解决，水浴法存在有消化不足现象，细胞膜较厚时需延长消化时间。消化在杂交中起着重要的作用，胃酶的浓度、时间和温度，如消化不够或太过则杂交失败可能性较大。从变性方法来看，共变性法较甲酰胺法效果要

17、好，杂交率高，背景清晰，荧光信号亮，且操作简单快捷。原因分析：共变性使细胞DNA和探针处在共同的温度、湿度环境中变性、杂交，减少了-20乙醇防复性的影响，另外，无甲酰胺pH值的影响。综上所述，FISH技术检测hTERC基因成功与否的关键在于制片质量、胃酶消化浓度和时间，其次为变性时间和温度上的掌握。本实验表明: 应用FISH技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时,比较上述多种方法,其中以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法消化和共变性杂交成功率最高。 值得注意的是,消化的浓度和时间可根据每张制片细胞的具体情况灵活进行调整。FISH技术因其具有较高特异性、敏感性和快速、操作

18、简单、无创等特点，从一定程度上弥补现行宫颈癌和癌前病变筛查方法的局限性，因此可作为临床宫颈疾病筛查一项重要的辅助检查。【参考文献】 1 HeselmeyerHaddad K, Sommerfeld K,White NM, et al.Genomic amplification of the human telomerase gene( TERC) in pap smears predicts the development of cervical cancerJ. Am J Pathol, 2005, 166: 12291238.2 Garaway NP, Khanna A, Dawlett M, et al. Gain of the 3q26 region in cervicovaginal and squamous cell carcinomaJ. Gynecol Oncol, 2008,110: 37 42.3 Andersson S, Wallin KL, Hellstrom AC， et al. Frequent gain of the human telomerase gene TE